健康與腹瀉幼犬腸道菌群的比較研究

摘要：通過對健康幼犬和腹瀉幼犬的腸道菌群進行研究，對兩者之間的差異進行探討，以指導(dǎo)臨床對腹瀉的治療。無菌采取健康幼犬和腹瀉幼犬的糞便，通過選用不同選擇性培養(yǎng)基，對其糞便微生物進行分離培養(yǎng)。比較兩者菌群的差異，并篩選優(yōu)勢菌株，研究其生長特性以及通過生化試驗進行確認(rèn)。健康幼犬與腹瀉幼犬糞便中常見細(xì)菌有腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌等，其數(shù)量的變化比較，腹瀉幼犬糞便中腸球菌和乳酸桿菌的數(shù)量降低明顯，雙歧桿菌數(shù)量略有下降，腸桿菌的數(shù)量有不顯著增加的趨勢。腸道菌群失調(diào)易引起腹瀉，臨床上應(yīng)正確治療腹瀉，避免濫用抗生素。

關(guān)鍵詞：幼犬；腸道菌群；腹瀉；選擇培養(yǎng)基

中圖分類號：S858.292文獻標(biāo)識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.028

The Comparison Study on the Intestinal Microflora of the Healthy and Diarrhea Puppies

WEN Jian-xin

（College of Animal Sciences， Qindao Agriculture University ， Qingdao， Shandong 266109， China）

Abstract：Through the study on the intestinal flora of the healthy and diarrhea puppies， differences were explored between the two flora to guide the clinical treatment of diarrhea.After healthy and diarrhea puppy faeces were adopted aseptically， the faecal micro-organisms were isolated and cultured to compare the differences between the two flora through the different selective media. The growing characteristics and the appearance of bacterium were analyzed and identified. The intestinal flora includes Enterobacteria， Enterococcus， Lactobacillus， Bifidobacterium etc. Compared with the number of bacteria in the intestinal canal of the healthy puppy， in the the intestinal canal of the diarrhea puppy，the number of Enterococci and Lactobacilli declined obviously， the number of Bifidobacteria declined little and the number of Enterobacteria had no significant increasing trend.Imbalance of intestinal flora was caused easily by the diarrhea，so the clinical treatment of diarrhea should be corrected to avoid the abuse of antibiotics.

Key words: puppies; intestinal flora; diarrhea; selective medium

在動物腸道中棲息著100多種大約1014個穩(wěn)定且能夠抵御致病菌和潛在致病菌侵襲的腸道正常菌群。腸道菌群間互相保持著共生或拮抗的關(guān)系，它們以宿主攝取的食物和分泌于消化道內(nèi)的機體成分作為營養(yǎng)，從而不斷地增殖和被排泄，它們與宿主的健康、疾病有著極其密切的聯(lián)系[2]。正常菌群作為宿主的組成部分，參與了動物體的生長、發(fā)育、消化、吸收、營養(yǎng)、免疫、生物拮抗及其各種功能和結(jié)構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展和衰退的全過程。動物與菌群保持動態(tài)的微生態(tài)平衡，在某些因素作用下，正常菌群會發(fā)生變化。當(dāng)有益菌占優(yōu)勢時，動物就會向健康的方向發(fā)展，而有害菌占優(yōu)勢時，最終會引起宿主的病變反應(yīng)。在正常狀態(tài)下，腸道菌群的組成、種類都是較為穩(wěn)定的。腸道正常菌群中95%以上為專性厭氧菌，兼性厭氧菌和需氧菌在正常菌群中所占比例很小;以厭氧菌占絕對優(yōu)勢的腸道正常菌群各成員間的平衡穩(wěn)定，能夠抵御致病菌和潛在致病菌的侵襲。

腹瀉是指由于腸蠕動亢進，腸內(nèi)水分吸收不全或吸收困難等原因，引起含有多量的水分的腸內(nèi)容物被排出而導(dǎo)致排便次數(shù)增加，糞便稀薄、含有黏液等。腹瀉是小動物臨床工作者經(jīng)常可以遇到的病癥，既可以是原發(fā)性的也可以是繼發(fā)的。而引起腹瀉的原因總是或多或少的與細(xì)菌／真菌性腸炎有關(guān)。臨床癥狀可以表現(xiàn)為自限性的輕微腹瀉到嚴(yán)重的水樣血瀉。根據(jù)各種研究與報道，臨床上最常見的導(dǎo)致犬腹瀉的病原菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌、彎曲桿菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、耶爾森菌、厭氧螺旋菌、志賀菌等。這些細(xì)菌常可以在健康動物糞便中分離出來，它們導(dǎo)致腹瀉的誘因一般與抗菌藥物的使用無關(guān)（除了產(chǎn)氣莢膜梭菌）。當(dāng)然，抗菌藥物的使用會影響犬腸道菌群的平衡狀態(tài)，尤其是長期大量的使用抗菌藥物有可能導(dǎo)致犬腸道菌群的嚴(yán)重失調(diào)，從而引發(fā)相關(guān)的腸道疾病，如抗菌藥物相關(guān)性腹瀉[4]。

由于糞便中的微生物占腸道微生物總量中的大部分，其構(gòu)成反映了整個消化系統(tǒng)的菌群狀態(tài)，又因為糞便采集容易、稱量方便，所以許多研究者常常通過分析糞便來研究腸道菌群。本試驗中對于腸道菌群的分析也通過對糞便進行稀釋，在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對菌落進行計數(shù)比較[3]。

幼犬?dāng)嗄糖昂竽c道菌群結(jié)構(gòu)和免疫屏障處于逐漸建立的過程中，當(dāng)腸道內(nèi)環(huán)境因食物改變等因素的影響發(fā)生變化時，菌群結(jié)構(gòu)容易遭到破壞而失調(diào)，因此是腹瀉的高發(fā)病期。以往對腸道菌群的研究相對集中在人和家畜，對犬等伴侶動物的研究甚少，本試驗通過對健康幼犬和腹瀉幼犬的糞便菌群研究，對兩者之間的差異進行探討，以指導(dǎo)臨床對腹瀉的治療[5]。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)基及主要試劑普通瓊脂培養(yǎng)基、甘油肉湯浸液瓊脂培養(yǎng)基、MRS乳酸菌選擇培養(yǎng)基、EC腸球菌選擇培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、EMB腸桿菌選擇培養(yǎng)基、TPY 雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基和生化試驗用培養(yǎng)基(葡萄糖蛋白胨水、蛋白胨水、三糖鐵培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基及五糖發(fā)酵管)，生化試劑（MR試劑、VP試劑、吲哚試劑等）美藍(lán)指示劑以及革蘭氏染液等。以上試劑均為分析純。

1.1.2試驗動物健康與腹瀉昆明幼犬，70日齡，由城陽批發(fā)市場提供。其中，腹瀉犬在采集糞便前3 d均未服用抗生素、止瀉劑以及微生態(tài)制劑。

1.2試驗方法

1.2.1昆明幼犬糞便的采集與處理糞便采集時使用清潔玻璃棒挑新鮮軟糞5 g左右，或用鑷子夾取新鮮軟糞置于容器中。用天平秤稱取0.5 g糞便，加入生理鹽水4.5 mL，放置在振蕩器上振蕩成勻漿，按10倍連續(xù)稀釋至10-9，根據(jù)前期預(yù)測實驗結(jié)果，乳酸桿菌選3個稀釋度10-5、10-7、10-8，腸桿菌和腸球菌學(xué)3個稀釋度10-3、10-5、10-7，雙歧桿菌選3 個稀釋度10-6、10-8 、10-9。各取100 μL滴于培養(yǎng)基上(普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、甘油肉湯培養(yǎng)基、EC培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、EC培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、TPY培養(yǎng)基)，雙歧桿菌和乳酸桿菌在37 ℃厭氧環(huán)境培養(yǎng)48 h，腸球菌和腸桿菌在37 ℃需氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h，然后計數(shù)[6]。

1.2.2厭氧培養(yǎng)的操作方法采用干燥器培養(yǎng)，1 m3空間用焦性沒食子酸10 g、10％氫氧化鈉溶液100 mL，按比例取10%的氫氧化鈉液置于干燥器皿底部，然后放置2到3個略高于液面的青霉素小瓶，再按比例稱取焦性沒食子酸用紙包好，放在圓柱上。繼而放上隔板，將接種完畢的培養(yǎng)基放于隔板上，同時放美藍(lán)指示劑一管。蓋上缸蓋并用石蠟封閉。再輕輕搖動干燥器，使焦性沒食子酸掉入氫氧化鈉液中，反應(yīng)后，干燥器內(nèi)無氧，美藍(lán)指示劑由藍(lán)變白[7]。置于溫箱37 ℃培養(yǎng)24～48 h觀察結(jié)果。

1.2.3需氧培養(yǎng)的操作方法將接種完畢的培養(yǎng)基放于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察培養(yǎng)結(jié)果。

1.3腸道細(xì)菌的純化

1.3.1腸道物培養(yǎng)出的菌落的純培養(yǎng)挑取培養(yǎng)37 ℃ 、24 h的培養(yǎng)皿從溫箱取出，分別挑取健康與腹瀉幼犬腸道物分離的單個菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，證明不含雜菌，此時用接種環(huán)挑取單個菌落，移植于固體培養(yǎng)基（普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱、甘油肉湯浸液瓊脂、SS、MRS、EC、EMB、TPY培養(yǎng)基）。接種完畢，分別在平皿底部注明菌號、日期等標(biāo)記，置于37 ℃再分別進行需氧和厭氧培養(yǎng)24～48 h，觀察固體培養(yǎng)基上菌落生長的形態(tài)，對不同的菌落進行分辨、歸類，篩選出優(yōu)勢菌株。挑純需氧菌和厭氧菌，直至分離到純培養(yǎng)物。將分離純化的菌落培養(yǎng)24～48 h后，保存于冰箱中，待進一步鑒定。

1.3.2菌落形態(tài)特征觀察描述分離純化得到的單個菌落在培養(yǎng)基上生長的形態(tài)特征。

1.4細(xì)菌的革蘭氏染色觀察

1.4.1 細(xì)菌抹片的制備用滅菌接種環(huán)取少量生理鹽水，置于玻片中央，然后再用滅菌接種環(huán)挑取培養(yǎng)24～48 h后的單個菌落，在液滴中混合，均勻涂布成適當(dāng)大小的薄層。待其自然干燥后火焰固定。

1.4.2 細(xì)菌抹片的革蘭氏染色及油鏡鏡檢[8]在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫溶液，經(jīng)過3 min后水洗，進行初染。加革蘭氏碘液于抹片上作用3 min后水洗，進行媒染。然后加95%酒精于抹片上作用30 s水洗脫色。加石炭酸復(fù)紅經(jīng)1 min水洗，進行復(fù)染。吸干，滴加香柏油于抹片上鏡檢。觀察每種細(xì)菌的形態(tài)、大小與排列方式，并作比較。

1.5細(xì)菌的生化試驗

1.5.1糖發(fā)酵 每種培養(yǎng)物分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖微量生化培養(yǎng)管中，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.5.2吲哚試驗在蛋白胨水中每種菌接種一管，培養(yǎng)24～48 h后作吲哚試驗。于培養(yǎng)液中加入二甲苯3滴，搖勻，靜置片刻后，沿管壁加入吲哚試劑3滴觀察結(jié)果。

1.5.3甲基紅（MR）試驗、維培二氏（VP）試驗在葡萄糖蛋白胨水每種菌接種兩管，培養(yǎng)24～48 h后，一管作MR試驗，另一管作VP試驗。取出培養(yǎng)液，每管分別加入MR試劑和VP試劑各4滴，靜置在試管架上片刻，觀察結(jié)果。

1.5.4枸櫞酸鹽利用試驗在枸櫞酸鹽瓊脂中純培養(yǎng)細(xì)菌接種，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.5.5三糖鐵試驗在三糖鐵瓊脂中接種純培養(yǎng)細(xì)菌，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.5.6觸媒試驗用接種環(huán)將1菌落放于載玻片的中央，加1滴3%雙氧水于菌落上，立即觀察有無氣泡出現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征的結(jié)果描述

健康幼犬與腹瀉幼犬腸道內(nèi)細(xì)菌的單個菌落在培養(yǎng)基上生長的形態(tài)特征相同，見表1。

2.2 細(xì)菌的革蘭氏染色及涂片鏡檢的結(jié)果

健康幼犬與腹瀉幼犬腸道內(nèi)細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果相同，見表2。

革蘭氏染色后發(fā)現(xiàn)1、2、3號菌為革蘭氏陰性桿菌，兩端鈍圓(1.0～3.0)mm×(0.4～0.7)mm的短桿菌，多數(shù)散在排列，也有2、3個菌體連在一起；8、10號菌為G+桿菌，2—15×1.0 μm，成雙或短鏈狀排列；11號菌為G+球菌，1×1 μm，單個、成對或短鏈排列。見圖1~5。

2.3細(xì)菌的生化試驗結(jié)果

健康與腹瀉幼犬腸道內(nèi)細(xì)菌的生化實驗結(jié)果相同，見表3。

2.4結(jié)果分析

根據(jù)菌落形狀、革蘭氏染色鏡檢形態(tài)和各生化反應(yīng)特征，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》綜合判斷，確定分離純化菌株的種屬。可以得出：G-桿菌中，1號菌株為沙門氏菌；2號、3號菌株為大腸桿菌；4號菌因?qū)嶒炇覘l件有限未鑒定。G+桿菌中，5號、7號菌株為乳桿菌；6號菌為雙歧桿菌；8號菌為腸球菌。

健康幼犬與腹瀉幼犬糞便中細(xì)菌數(shù)量的變化比較， 腹瀉犬糞便中腸球菌和乳酸桿菌的數(shù)量降低極為顯著， 雙歧桿菌的數(shù)量顯著減少， 而腸桿菌的數(shù)量變化有增加的趨勢，見表4。

3討論

目前報道的腸道正常菌群主要菌屬有腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、梭桿菌、擬桿菌(類桿菌)、雙歧桿菌。有關(guān)腸道菌群的數(shù)據(jù)主要來自對糞便菌群的研究 。腸道菌群數(shù)量龐大，構(gòu)成極為復(fù)雜。已知大腸內(nèi)寄居著 50 多個屬、500 多種細(xì)菌，腸內(nèi)容物的細(xì)菌量約為 1012 cfu·g-1，其中雙歧桿菌屬、類桿菌屬、消化鏈球菌屬等專性厭氧菌約占腸道總菌量的 99%， 腸桿菌科、腸球菌屬等兼性厭氧菌約占總菌量的1%[9] 。在消化道中由于不同腸段的解剖結(jié)構(gòu)不同，其細(xì)菌組成的比例各不相同。小腸中細(xì)菌總數(shù)隨小腸長度的增加而減少。盲腸和結(jié)腸是細(xì)菌量最大的部位，優(yōu)勢菌由嚴(yán)格厭氧菌組成，主要有擬桿菌(革蘭陰性無芽孢桿菌)，也有大量的革蘭陽性嚴(yán)格厭氧菌，如真桿菌、雙歧桿菌、鏈桿菌、消化鏈球菌、消化球菌等[10]。

根據(jù)菌落形狀、革蘭氏染色鏡檢形態(tài)和各生化反應(yīng)特征，可以初步得出：分離出大腸桿菌、沙門氏菌、乳酸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌。本試驗分離與鑒定的結(jié)果與相關(guān)報道的正常菌群有一定的出入，但基本一致。分析原因主要是現(xiàn)在對它的了解還很少，純培養(yǎng)的問題也沒有解決，因而在實際分離數(shù)量上常有出入，再加上試驗條件和方法的限制，有些正常菌群如擬桿菌、酵母菌等無法分離鑒定出來。

人和動物等宿主體內(nèi)定植有數(shù)千億的細(xì)菌，是在出生后通過與外界環(huán)境的接觸逐漸建立起來的，但是斷奶期間由于食物成分和狀態(tài)的改變，腸道內(nèi)菌群的數(shù)量和比例又一次發(fā)生變化，在斷奶后2周逐漸穩(wěn)定，即所謂的腸道的正常菌群。結(jié)腸的主要菌種呈相對穩(wěn)定、無致病作用，即宿主、細(xì)菌及腸內(nèi)生態(tài)環(huán)境呈平衡狀態(tài)。因此，我們可以研究健康動物糞便的主要菌群，從而探討在病理狀態(tài)下糞便菌群變化的臨床意義[11]。

本試驗中腸球菌、乳酸菌、腸桿菌的數(shù)量與近期的報道的成年犬糞便中的數(shù)量趨于一致，腹瀉幼犬在本試驗中位于腸道黏膜表層的需氧腸球菌數(shù)量顯著減少， 腸桿菌數(shù)量有增加的趨勢，腸黏膜內(nèi)層的乳酸桿菌也顯著減少，雙歧桿菌也顯著減少。腸黏膜內(nèi)層有益菌群數(shù)量的減少， 增加了病原菌與腸黏膜吸附的機會，導(dǎo)致腸黏膜的破壞，從而進一步加劇腹瀉的發(fā)生。腸道菌群數(shù)量的改變，比例的失調(diào)可使致病菌產(chǎn)生作用而導(dǎo)致腹瀉。腹瀉與腸道菌群失調(diào)互為因果，所以腹瀉病犬不應(yīng)盲目使用抗生素，因抗生素可消滅敏感的具有保護屏障和拮抗外襲菌作用的有益菌，加重菌群失調(diào)，并且引起真菌感染加重腹瀉。在臨床實踐中治療腹瀉時不應(yīng)盲目使用抗生素進行治療，防止進一步加劇菌群的紊亂，而應(yīng)考慮合理使用微生態(tài)制劑進行輔助治療。

在本試驗中，腹瀉幼犬與正常幼犬相比，位于腸道黏膜表層的需氧腸球菌數(shù)量顯著減少，腸桿菌數(shù)量有增加的趨勢，腸黏膜內(nèi)層的乳酸桿菌顯著減少，雙歧桿菌也明顯減少。腸道細(xì)菌數(shù)量失調(diào)，可能是導(dǎo)致腹瀉的原因。進一步的研究工作仍在進行之中。

致謝：本研究是在王壽山做了大量實驗室工作幫助下完成的，在此表示感謝。

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