醋酸銨法提取卵形鯧鲹基因組DNA

摘要：建立了一種簡便、安全、經濟的提取卵形鯧鲹基因組DNA的方法，即醋酸銨法。該方法采用7.5 mol·L-1醋酸銨代替酚、氯仿，通過高鹽-SDS去除蛋白和多糖，異丙醇在一定濃度醋酸銨存在條件下選擇性沉淀DNA，而不沉淀蛋白，并通過酶切和AFLP驗證該法抽提的DNA純度。該法提取的DNA質量較高，無蛋白質和RNA污染，較酚/氯仿法和試劑盒法抽提得到量多，酶切和AFLP試驗結果表明，提取的DNA可用于酶切分析和分子標記等試驗。此法安全、簡便、經濟，該方法更適合于對大量樣品的提取。

關鍵詞：卵形鯧鲹；DNA抽提；醋酸銨法

中圖分類號：S965.331文獻標識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.029

Ammonium Acetate Method to Isolate High Quality Genomic DNA of Trachinotus ovatus

PENG Min， CHEN Xiu-li， JIANG Wei-ming，YANG Chun-ling，LI Yong-mei

(Guangxi Fisheries Research Institute， Nanning ， Guangxi 530021， China)

Abstract：High-quality DNA was an important base of molecular biology manipulation， such as molecular markers. Ammonium acetate method， a simple， economical and safe methodwas presented to isolate high quality DNA from Trachinotus ovatus. Instead of phenol and chloroform， 7.5 mol·L-1 ammonium acetate was used to remove proteins and polysaccharides in an SDS extraction buffer in this method. With a certain concentration of ammonium acetate， isopropyl can selective precipitate DNA without protein . The purity of DNA was validated by restriction enzyme digestion and AFLP analysis. The DNA extraction by ammonium acetate has high-quality， has not protein and RNA pollution， has higher yield compared with phenol/chloroform extraction method and kit method. The results of restriction enzyme digestion and AFLP showed that the purity of the obtained DNA was good enough for the further biotechnology experiment such as digestion by restriction enzyme， molecular marker and so on. This method was safe， simple and economical. This ammonium acetate method was more practical for extraction of a large number of samples.

Key words: Trachinotus ovatus；DNA extraction；ammonium acetate method

目前常用的分子標記技術如RAPD、AFLP、微衛星等都是以DNA為基本材料。因此，高質量DNA的提取至關重要[1-2]。卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus) （Linnaeus）俗名金鯧魚，地方名稱黃臘鯧、金鯧、黃臘鲹、短鰭鯧等，屬硬骨魚綱鱸形目、鲹科，鯧鲹屬，廣泛分布于大西洋、印度洋、太平洋，是一種暖水性魚類。卵形鯧鲹是中國近幾十年來廣泛開發的養殖對象，魚肉無脊間刺，肉質細嫩，味道鮮美，歷來被列為名貴食用魚類，經濟效益顯著。為了更好地持續開發和利用卵形鯧鲹，需要研究其遺傳多樣性，為品質改良和養殖提供依據。本試驗首先從肌肉組織提取基因組DNA。在提取試驗過程中，由于樣品量大，對DNA要求質量高，我們發現常規的酚/氯仿抽提法不夠理想，操作繁瑣，且酚和氯仿有毒，試驗危險性大，而采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒抽提DNA，費用較高，且獲得量少。為此，我們嘗試用醋酸銨提取卵形鯧鲹基因DNA，在降低試驗成本和減少健康危險的同時，獲得高質量的基因組DNA。

1材料和方法

1.1材料

樣品采自北部灣海區。冰鮮運輸回實驗室后，取其背部肌肉保存于-80℃冰箱中。

1.2試劑

DNA 提取緩沖液（10 mmol·L-1 Tris-HCl(pH8.0)，100 mmol·L-1 EDTA(pH 8.0)，2％SDS）、蛋白酶K（TIANGEN）、胰RNA酶（TIANGEN）、醋酸銨(AR)、異丙醇(AR)、乙醇(AR)、滅菌ddH2O。

1.3提取DNA

參照王偉繼[3]和SAFS[4]的醋酸銨法并加以改進。作為比較，同時也進行了常規的酚/氯仿法和TIANGEN海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取卵形鯧鲹基因組DNA。

稱取肌肉組織100 mg，加入600 μL DNA提取緩沖液，剪碎后加入12 μL 20 mg·mL-1蛋白酶K(終濃度400 μL·mL-1) ，充分混勻后放人56 ℃水浴鍋中溫浴3 h；取出冷卻至室溫，加入200 μL·mL-17.5 mmol·L-1醋酸銨溶液，顛倒混勻2 min，14 000 r·min-1 離心5 min，取上清至另一離心管。加入等體積預冷異丙醇，-80 ℃放置15 min。隨后14 000 r·min-1 離心5 min，沉淀用70%洗滌2~3次；自然干燥后，加入100 μL滅菌ddH2O，加入1 μL 10 mg·mL-1胰RNA酶37 ℃水浴30 min。

1.4DNA質量分析

1.4.1DNA瓊脂糖電泳檢測用1%瓊脂糖凝膠(含0.03‰GELRED染料)電泳檢測，凝膠成像系統觀察分析。

1.4.2DNA純度及濃度的測定提取的DNA經稀釋100倍后，分別在BioRAD核酸蛋白測定儀檢測260，280，270，230 nm的光吸收值，計算DNA的純度和濃度。

1.4.3DNA的Sau3AI酶切、EcoRI和PstI雙酶切分析Sau3AI酶切反應：2 μL 10×NEBuffer 1 緩沖液，100×BSA 0.2 μL，DNA 750 ng，Sau3AI 10 U， 補足滅菌雙蒸水至20 μL。混勻后37 ℃溫育過夜，65 ℃終止酶切反應20 min。1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA酶切結果。

EcoRI和PstI雙酶切反應： 2 μL 10×NEBuffer3緩沖液，100×BSA 0.2 μL，DNA 750 ng， EcoRI 10 U，PstI 10 U ，補足滅菌雙蒸水至20 μL。混勻后37 ℃溫育過夜，80 ℃終止酶切反應20 min。1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA酶切結果。

1.4.4DNA的AFLP分析參照Zabeau[5]、Branko[6]和Vos[7]進行AFLP分析，選擴PCR產物用6%變性聚丙烯酰胺分離檢測。

2結果與分析

2.1DNA電泳檢測

用醋酸銨法提取的DNA電泳圖譜與用于試劑盒提取的基因組DNA及酚/氯仿法提取的基因組DNA 圖譜相同(圖1) ，電泳條帶集中、清晰、點樣孔亮度很低，說明DNA分子完整，3種方法均可以較好的去除RNA及蛋白質的污染。

2.2DNA純度及濃度

3種方法提取的基因組DNA純度及濃度檢測結果列于表1。由表1可知，3種方法提取的基因組DNA的A260/A280 均在l.60~2.00 之間，表明提取的DNA 較純，無蛋白和RNA污染，A260/A270均大于1.2，表明沒有酚污染。但是常規的酚／氯仿法和試劑盒所提取的基因組DNA A260/A230均小于2.0，說明DNA中有一些雜質的污染。3種方法中，醋酸銨法所得的DNA量最多，試劑盒所得量最少。

2.3DNA的酶切分析

醋酸銨法提取的基因組DNA經Sau3AI(圖2)、EcoRI和PstI（圖3）過夜消化后，瓊脂糖凝膠電泳表明DNA 能被是EcoRI、PstI有效雙酶切以及Sau3AI有效酶切，說明提取的DNA質量良好能用于限制性內切酶酶切分析、構建文庫及PCR擴增。

2.4DNA的AFLP分析

AFLP技術對模板DNA質量的要求很高，模板DNA的完整性和純度影響到內切酶是否充分酶切以及PCR擴增多態性結果。39份醋酸銨法提取的DNA模板經AFLP分析，酶切徹底，PCR擴增后的帶型清晰穩定，重復性好，進一步證實了所提取的DNA質量高，完全可以滿足AFLP試驗對模板DNA質量的要求。

3討論

通常情況下，核酸可與1價、2價陽離子形成鹽類，但在一定量的Tris-Cl和EDTA存在下可避免鹽與DNA的共沉淀，不妨礙所提取DNA的質量[1]。在一定濃度的醋酸銨存在條件下，異丙醇能選擇性地沉淀DNA，而不能沉淀蛋白，而且也不易沉淀部分降解的RNA，本方法充分利用這個規律，有效地去除了雜蛋白，也去除了大部分的RNA，提高了DNA的純度[8]。

檢測DNA純度最佳的辦法是采用 EcoRI等限制性核酸內切酶對DNA 進行酶切消化，只有能被酶切完全并可用作PCR模板的基因組DNA，才能證明其純度高，所含蛋白質、多糖類等雜質少，才能進一步用于AFLP、RFLP、Southern雜交等分子生物學的研究[9]。高純度的DNA沒有雜蛋白，這樣有利于內切酶的活性作用，還由于可以經受長時間的酶切，僅加入1U-2U內切酶過夜酶切就足夠充分切開DNA，節省了寶貴的內切酶。高純度DNA也利于后續試驗(如酶切分析、構建文庫及PCR 擴增等)[8，10]。

本試驗采用醋酸銨從卵形鯧鲹的肌肉組織中獲得了高濃度及完整性非常好的基因組DNA。所獲得的基因組DNA無論從純度、完整性等方面都完全適合酶切、AFLP試驗[3]。采用醋酸銨提取基因組DNA，得率較高，并且醋酸銨法容易制備，操作簡單，價格便宜，減少了酚、氯仿等有機溶劑對環境的污染，降低對操作者的健康損害，同時降低了試驗費用，用醋酸銨代替酚、氯仿和試劑盒進行抽提基因組DNA是較為實用的方法。本方法對大量樣品的提取更為實用。

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