大鼠牙髓干細胞與骨髓間充質干細胞分化成骨樣細胞能力對比研究

[摘要]目的：以骨髓間充質干細胞作為參考，討論牙髓干細胞作為骨組織修復種子細胞的可行性。方法：通過酶消化法獲得大鼠牙髓干細胞，離心法獲得骨髓間充質干細胞，貼壁培養，通過倒置光學顯微鏡觀察二者形態差異；流式細胞技術鑒定骨髓間充質干細胞的間質細胞表面標志物表達；ＭＭＴ法檢測細胞生長曲線；特定的成骨誘導液誘導干細胞成骨分化，免疫熒光法檢測成骨細胞表面標志物表達。結果：分離的大鼠骨髓間充質干細胞與牙髓干細胞形態學以及生長特性具有相似性，且符合間充質干細胞特性，牙髓干細胞第4天進入對數生長期，第7天進入平臺期，骨髓間充質干細胞第4天進入對數生長期，第8天進入平臺期；經過成骨誘導后二者都具備成骨樣細胞分化能力，牙髓干細胞在成骨誘導后的骨鈣素表達上與骨髓間充質細胞有著相似的能力；牙本質泌涎蛋白表達陽性。結論：牙髓干細胞具有與骨髓間充質干細胞都具有成骨分化能力，但牙髓干細胞細胞成分相對復雜，增殖能力較強。

[關鍵詞]牙髓干細胞；培養；誘導；成骨樣細胞

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）04-0597-03

Comparative study on the capacity of rat dental pulp stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells in differentiating to osteoblast-like cells

ZHAI Xu，CAO Rui，CAI Lei，WU Jing-guo，SUN Xue-jian，LV Chang-sheng

(Research Center of Plastic Surgery Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing 100144，China)

AbstractObjectiveTo research the capacity of dental pulp stem cells which was induced to osteoblast-like cells ， by comparing bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Pulps and bone marrow were isolated from 6-weeks rats，then pulps was been digested by collagenase I. morphology difference was distinguished by optical microscope. FCM(flow cytometry) was uesd for identifying the purity of BMSCs. Drawing growth curves for cells was chooen. Cells was introduced by osteogenetic induced flow. OCN and DSP were targeted in immunofluorescence test， as being oseteo-markers.ResultsCells isolated from rats tissues were corresponded to the mesenchymal cell. Cells proliferated faster at the fourth day after cultivation.Both of the tow cells have the capacity of differentiating to osteoblast-like cells though inducing cultivation. OCN and DSP were detected on both cells.ConclusionDPSCs had the same capacity to differentiate to osteoblast-like cells with BMSCs，and got a more ability of proliferation.

Key words:dental pulp stem cells;cultivation;inducing;osteoblast-like cells

骨組織缺損修復研究是近年來研究較多的熱門學科，越來越多的研究者著眼于通過干細胞分化修復骨缺損類相關疾病，并獲得了初步的進展。骨髓間充質干細胞（BMSCs）是目前人們研究較多的一類多能干細胞，通過誘導可以分化為成骨樣細胞[1]。2000年Gronthos[2]等發現牙髓干細胞(DPSCs)，為干細胞研究提供了一類新的種子細胞。研究表明DPSCs在分化潛能上具有多能干細胞的特點，經誘導可以向脂肪，神經等方向分化[3-4]。嚙齒類動物的一生中牙齒會不斷的磨損與消耗，新生的組織又會不斷的對其進行修復[5]，由此可見DPS Cs具有較強的成骨分化能力。本實驗通過誘導大鼠BMSCs與DPSCs向成骨細胞分化，并對其進行相關技術檢測，將二者進行比較，為骨組織缺損修復種子細胞的研究提供一定的依據與技術方法。

1材料

1.1 實驗動物：SD大鼠（6周齡）由北京協和醫學院整形外科醫院提供。

1.2 試劑：DMEM培養基（Hyclone），胎牛血清（Gibco），雙抗，I型膠原酶，胰酶(Sigma)，噻唑藍（MTT），二甲基亞砜（DMSO），地塞米松，抗壞血清，β-甘油磷酸鈉（Sigma），抗大鼠CD90單抗IgG，抗大鼠CD45單抗IgG（eBioscience，USA），抗大鼠osteocalcin單抗，抗大鼠DSP單抗（SANTA CRUZ ，USA），FITC標記山羊抗兔IgG(康為世紀，北京)。

2方法

2.1 取材與細胞培養：將6周齡SD大鼠斷頸處死，75%酒精浸泡消毒。無菌條件下，切開取出股骨與脛骨；剪斷股骨脛骨干骺端，2ml注射器吸取PBS反復沖洗骨髓腔以及干骺端，洗出液1 000rpm離心6min。反復消毒口腔后，分離下頜骨，無菌條件下分離大鼠下頜切牙牙髓組織，PBS反復沖洗三次，1%的I型膠原酶37℃消化1.5h后800rpm離心6min。分別將上述兩種離心液棄上清，加入含10%FBS，1%雙抗的DMEM培養基重懸，經200目濾網過濾，CO2溫箱培養，原代次日換液，以后每間隔一天換液一次。待細胞80%～90%融合后胰酶消化傳代培養。

2.2 MTT檢測：分別取BMSCs和DPSCs的P2代細胞以每孔5 000個的密度接種至96孔板，待大部分細胞貼壁后加入5mg/ml的MTT液20μl，溫育4 h后小心吸出液體，加入150μlDMSO，溫育10min后吸出在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。每日測量，連續10天標記個點繪制生長曲線。

2.3 流式細胞儀檢測：分別取二者P2代細胞，細胞計數后稀釋至10 000/ml，以1ml/管加入EP管，編號后分別加入100μl CD45，CD90抗體以及相關同型對照，4℃作用1h，10 000rpm離心2min去上清，加入PBS清洗，離心去上清，反復清洗三次后經流式細胞儀檢查表面CD45，CD90表達。

2.4 成骨分化誘導：將P2代BMSCs和DPSCs分別接種至六孔板，加入含10%FBS，10nm/L地塞米松，50μg/L抗壞血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的成骨誘導培養基進行誘導培養。兩周后細胞爬片進行免疫熒光染色，觀察經誘導后細胞OCN與DSP的表達情況。

3結果

3.1 光鏡下觀察：光鏡下可見大鼠BMSCs呈梭形生長，核圓位于細胞中間，形態狹長的細胞彼此連接，胞漿透亮，可見散在成集落生長的細胞群（見圖1A）。DPSCs光鏡下形態呈多角形，細胞成簇生長，內部緊密處細胞較多，且排列較為集中，形態已多邊形為主，邊緣處細胞生長較為稀疏，細胞形態狹長類梭形，胞質豐富，細胞核圓，居中（見圖1B）。

3.2 細胞生長曲線：P1代細胞傳代后經過1天培養大部分細胞貼壁，換液后將無法貼壁的細胞清除，以后隔日換液一次，每日分別測量96板中3孔的吸光值取平均值，連續檢測10天。通過吸光值的變化繪制生長曲線。可見，加入的細胞在前3天變化相對較小，在第4天進入生長的對數期，生長隨度增快，并在第7天左右進入生長平臺期（見圖2），DPSCs的增殖分裂的速度相對BMSCs相比更為旺盛，并且通過光鏡觀察在96孔底部牙髓干細胞排列更為緊密。

3.3流式細胞表面標志物檢測：通過流式細胞標志物檢測發現，經過傳代培養，接受檢測的P2代BMSCs細胞形態大小相對集中，由造血干細胞表面表達的標志物CD45為陰性，陽性率<1%，間充質系細胞表達的CD90為陽性，雙峰，與同型對照相比陽性率>82.9%（見圖3）。

3.4 成骨分化：P2代DPSCs與BMSCs經礦化液誘導約兩周后，分別進行OCN和DSP免疫熒光染色，可見經誘導DPSCs表達OCN陽性（見圖4B），DSP陽性(見圖4D);BMSCs表達OCN陽性(見圖4A)，DSP陰性（見圖4C）。培養四周后DPSCs茜素紅染色可見鈣化結節（見圖5）。

4討論

全骨髓貼壁法培養骨髓干細胞，雖然不能從免疫學角度最大化的區分骨髓中細胞的復雜性，但通過貼別，傳代的進行，P2代細胞的流式細胞技術檢測可以發現所培養的骨髓干細胞細胞大小較集中，表面標志物顯示特異性表達CD45分子的造血干細胞基本消失，得到相對較純的間充質細胞的同時盡可能減少了免疫學分選給細胞帶來的損傷。DPSCs作為來源于牙髓組織的間質干細胞定位于牙髓內微血管周圍[6]其周圍細胞外基質主要是I型膠原和III型膠原可被I型膠原酶消化分解，通過形態學和細胞培養的觀察消化過程不會影響細胞活性以及分化能力。

BMSCs在原代培養的前兩天可見大量的血細胞懸浮，經過換液可將懸浮的紅細胞，白細胞等清除，傳代后細胞充分生長，可見成梭狀貼壁生長的細胞。DPSCs則相對貼壁較快，可見呈長梭形，多角形細胞分布，在細胞間連接建立后生長進入對數期，增殖增快，其形態與BMSCs相比體積略小，形態也更近似多角形。 Bleicher等[7]研究發現牙髓根部與尖部的DPSCs牙本質細胞在修復牙本質過程中OCN表達具有差異性。流式細胞學檢測中可以發現DPSCs的散點圖表現為前，側向散射光跨度較大，這表明接受檢測的P2代細胞在形態大小上較為分散，細胞內胞質所含顆粒情況也相對差異較大[8]，相比較BMSCs則表現的相對均一集中。

OCN是成骨細胞合成的一種非特異性蛋白，其與骨的鈣化以及鈣的運輸有關，同時其能夠抑制羥基磷灰石異常結晶的形成的功能在成骨過程中起到關鍵的作用[9]。在體外試驗中OCN可作為成熟成骨細胞的標志隨著成骨細胞分化的增加表達增多[10]。通過免疫熒光染色發現，在本試驗中經過兩周誘導，DP SCs的OCN表達與BMSCs相比，在陽性率以及表達強度上相似。DSP作為成牙本質細胞分化過程中表達的蛋白，在成牙本質過程中起到重要作用[11]，經過誘導兩周后的檢測，DPSCs的DSP表達陽性，表明其在礦化誘導過程中與BMSCs也存在著一定差異，前者分化的成骨樣細胞更傾向于成牙本質細胞。成骨誘導培養四周，進行茜素紅染色可見細小的鈣結節沉積于培養基底部，進而進一步證實了DPSCs的成骨能力。

隨著組織缺損與修復的研究投入增加，干細胞移植成為修復缺損性疾病，以及再造組織的重要治療手段，從種子細胞，培養誘導方法，檢測手段等各個方面都得到了飛速發展。其中對于骨髓間充質干細胞的研究尤為深入[12-13]。因此以骨髓間充質干細胞作為對比，研究牙髓干細胞在成骨誘導液誘導下的分化能力具有較高的參考價值。本實驗相關研究表明，大鼠牙髓干細胞具有與骨髓間充質干細胞相似的成骨能力，細胞增殖，克隆形成能力也較強，可在誘導后兩周接種待成骨部位，適合作為骨組織缺損修復的種子細胞。

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[收稿日期]2010-11-25[修回日期]2011-02-26

編輯/張惠娟