人胚胎成纖維細胞作為組織工程皮膚種子細胞的可行性研究

[摘要]目的：評估人胚胎成纖維細胞（human embryonic fibroblasts，HEF）作為組織工程皮膚種子細胞的可行性和優越性。方法：取人流產胚胎皮膚、正常兒童皮膚，相同條件下分離培養成纖維細胞，比較兩組細胞鏡下、超微結構以及增殖特性，異體淋巴細胞混合實驗對比其抗原性。以第三代細胞復合鼠尾膠原構建三維培養，ELASA法分別測定兩組三維構建培養液中IL-6，TGF-β1含量。結果：與普通成纖維細胞相比，胚胎成纖維細胞擴增后具有更好的細胞形態和功能，生長速度快，分裂指數高，幾乎不刺激異體淋巴細胞增殖。在鼠尾膠原支架中成纖維細胞生長狀態良好，并且具有一定的組織強度。胎兒成纖維細胞組培養液中的TGF-β1和IL-6在各個時相上分別顯著低于和高于普通成纖維細胞組。結論：胚胎成纖維細胞是組織工程皮膚較理想的種子細胞。

[關鍵詞]】組織工程；皮膚；無斑痕愈合；胚胎；成纖維細胞

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）04-0605-04

Investigation on feasibility of constructing engineered skin substitutes with human embryonic fibroblasts

LIU Liu1，LI Wu-de1，CAI Guo-bin2

（1.Cleft lip and Palate Treatment Center，China Meitan General Hospital，Beijing 100028，China;2.Scar Integrated Treatment Centre，Plastic Surgery Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences， Peking Union Medical College，Beijing 100041，China）

Abstract:ObjectiveTo assess the biological and functional properties oftissue-engineered three-dimensional (3D) composites seeded with human embryonic fibroblasts （HEF）.MethodsFibroblast cultures were developed from biopsies of human fetus and children. To determine the differences between fetal and adult fibroblasts， the cell shape， ultrastructure， growth cycle were observed. In addition， mixed lymphocyte culture was examined to evaluate the antigenicity. Three-dimensional skin constructs were obtained by seeding cultured cells in rat tail collagen scaffold. The content of IL-6 and TGF-β1 in the dermis culturing supernatant was measured by ELISA method.ResultsIn monolayer culture， HEF displayed more typical pattern and faster growing rate. HEF was poor stimulators of lymphocyte proliferation. In 3D culture， fetal constructs appeared more developed based on gross examination with significantly higher level secretion of IL-6 and lower of TGF-β than adults'(P<0.05).Conclusion Fetal dermal fibroblasts may be an effective source of cells for fabricating skin equivalents.

Key words: tissue engineering; skin; scarless wound healing; fetal fibroblast

尋找理想的種子細胞一直是組織工程皮膚領域的熱點和難點，由于種子細胞增殖能力有限、抗原性、與基質相容性差等問題，存在著皮膚產量低，移植后排斥反應等缺陷。前2/3妊娠期的胚胎在受到創傷后具有無瘢痕愈合的能力，而這種愈合能力完全是由胎兒自身組織細胞的內在特性決定的[1]。我們取材于人胎兒皮膚、兒童正常皮膚進行成纖維細胞培養，比較其生長特性、形態學、生長動力學以及免疫原性差異，并復合鼠尾膠原構建人工真皮，觀察種子細胞在三維構建中的增殖和功能，以探討人胚胎成纖維細胞（human embryonic fibroblasts，HEF）作為組織工程皮膚種子細胞的可行性和優越性，為組織工程種子細胞的選擇及將細胞移植用于臨床提供實驗依據。

1材料和方法

1.1主要儀器和試劑：MCO-15A型C02培養箱，倒置生物顯微鏡，超凈工作臺，臺式高速離心機，恒溫水浴箱，常規醫用手術器械，日本H-600透射電鏡；全自動蒸汽消毒器，針式濾器；培養基（DMEM:F12為1:1，含10%胎牛血清），中性蛋白酶。

1.2 二維培養以及相關實驗

1.2.1 成纖維細胞取材：①實驗組：5例，取人孕中期（20～28周）引產胎兒，性別不限；②對照組：12例，取自12歲以下瘢痕患者手術改形時修剪下的正常皮膚。

1.2.2 成纖維細胞的培養和傳代：采用組織塊法培養：將標本消毒后無菌條件下取中厚皮，切成1～1.5mm3的小塊，將組織塊貼到培養瓶內，加入培養基孵育，待成纖維細胞達60%～70%左右，傳代培養。取兩組第三代細胞進行光鏡、透射電鏡觀察，繪制細胞生長曲線。

1.2.3 淋巴細胞體外增殖實驗，參考文獻[2]中畢建軍等的方法，計量數據用均數士標準差(x±s)表示。P<0.05有顯著性差異，并繪制不同代數細胞cpm值變化趨勢圖。

1.3 三維培養以及相關實驗

1.3.1 制作三維構建：取第三代HEFs和普通FBs，制成1×106個/cm3細胞懸液。迅速與鼠尾膠原液、重組緩沖液（2.756g碳酸鈉、4.766gHEPES、0.35gNaOH溶于100ml蒸餾水中）以1200:4200:300的比例加入6孔培養板中，在孵箱內孵育30min后即形成膠原凝膠。加入DMEM:F12為1:1的含10%胎牛血清的培養基在孵箱內繼續培養。

1.3.2 測定構建培養液中TGF-β1和IL-6含量：分別在1天、3天、5天、7天、9天、11天、14天每天收集兩組各6個孔培養液，每次換液兩組加液量均為5ml，用人IL-6、TGF-β1 ELISA試劑盒檢測細胞因子含量。

2結果

2.1 二維培養階段

2.1.1光鏡下觀察：同等培養條件和時間，HEF貼壁覆蓋面積大于普通FB，HEF呈梭形、多邊形或不規則形，邊緣不整齊，極性排列不規則。細胞折光性強。普通細胞更容易呈束狀排列（圖1.1，圖1.2）。

2.1.2 透射電鏡下觀察：HEF（第三代）功能活躍，表現為細胞體積大，胞漿豐富，胞核及核仁增大，胞膜與核膜折皺加深，胞漿內微絲粗大，沿細胞長軸平行排列，未見細胞連接（圖2.1，圖2.2）。細胞質內含有豐富的粗面內質網、游離核糖體和發達的高爾基復合體。

2.1.3 同代(P3)HEF和普通FB細胞生長曲線：在細胞生長前3天，兩組細胞增殖速度相似，其后均進入對數生長期，HEF增殖速度超過普通FB，更早進入平臺期，而后HEF仍保持著較高的生長密度（圖3）。

2.1.4 淋巴細胞增殖實驗：普通FB：與對照組相比原代～V代均有明顯差異。組間比較：P0、P1與其它各代差異明顯(P<0.01)；P2與P3無明顯差異(P>0.05)，P2與P4，P5仍有明顯差異(P<0.05)；P3-VP5任兩代之間無明顯差異(P>0.05)。

HEF：與對照組相比原代有明顯差異（P<0.05），P1～P5未見明顯差異。組間比較：P0與各代間見明顯差異（P<0.05），其余各代間未見明顯差異(P>0.05) (見表1)。

2.2 三維培養階段：兩組培養液中TGF-β1和IL-6含量的比較：各組成纖維細胞培養后的第一天，即可檢測到一定水平的TGF-β1和IL-6。兩組細胞IL-6隨著培養時間的延長分泌量增多，到第9天到達穩定高值水平，至第11天于第7天含量比較無統計學意義（P>0.05）；胎兒組IL-6含量在各時間點都高于成人組（P<0.05）。TGF-β1胎兒組分泌隨著時間有緩慢增長，至第9天達到穩定高值。成人組增長幅度較大（P<0.05）；各個時間點胎兒組均低于成人組（見表2）。

3討論

3.1 HEF是構建組織工程皮膚的理想種子細胞，長期以來動物來源的胚胎成纖維細胞被廣泛深入研究，發現其在膠原沉積、細胞分泌，細胞信號傳導等方面存在一定的自主性[3]，在分子水平，胚胎皮膚創傷后其WNT信號通路途徑，細胞對WNT3a基因調控的應答都與普通FBs有本質區別[4]。2005年，Hohlfeld[5]等利用HEF與馬膠原覆蓋深度燒傷，發現燒傷創面愈合速度與質量都有明顯改善，大大推進了HEF組織工程皮膚的發展。但針對擴增后HEF的基礎實驗研究并不多見，本研究為填補這一薄弱環節，對HEF的二維、三維培養進行較全面觀察，再次驗證了胎兒無瘢痕愈合與細胞本身特性密切相關，也為組織工程皮膚種子細胞選擇和皮膚構建方法奠定了基礎。

3.2 二維培養中，與普通成體FB相比，HEF呈現出更加良好的細胞狀態，呈典型的紡錘狀，貼壁面積更大，生長更旺盛，細胞壽命更長。透射電鏡下HEF胞膜與核膜折皺加深，胞漿內微絲粗大，細胞質內含有豐富的粗面內質網、游離核糖體和發達的高爾基復合體，說明細胞的功能活躍。HEF約3天傳代一次，可傳25代而保持細胞基本形態。HEF細胞生長曲線近似“S”形，具有生長速度快，分裂指數高，代謝迅速和分泌功能旺盛的特點。以相同的初始接種密度培養，兩組細胞均具有密度依賴性抑制，但HEF比后者具有更大的最大生長密度，這可能是由于胎兒細胞體積小，容積相同時，數量較多，也可能是由于單位細胞消耗營養物質較少所致。

3.3 HEF與淋巴細胞混合培養幾乎可以不刺激其增殖，說明其低抗原性。HEF原代培養與對照組和其他代間均存在著顯著差異（P<0.05），可能與真皮組織中含有較多樹突狀細胞、淋巴細胞、內皮細胞[2]有關，這些細胞均具有較強的免疫原性，通過體外培養及傳代逐漸被去除。普通FB仍然有一定免疫原性，但隨著代數增加，普通FB刺激異體淋巴細胞增殖反應減弱明顯緩慢，其免疫原性較穩定。以往研究表明，HEF的HLA-DP，HLA-DQ，HLA-DR（與免疫排斥相關的重要HLA抗原）抗原陰性，經過培養后依然為陰性，而取自人成體的普通FB，原代和培養后都呈陽性，我們的結論與之相吻合[6]。機體中的免疫排斥雖然是以淋巴細胞為中心，但還有很多其它因素影響著免疫應答反應的發生、發展和結局，本研究的淋巴細胞混合實驗雖然能夠說明一定的問題，但還遠遠不夠。如何最大程度地模擬機體內環境，研究組織工程皮膚異體細胞移植后的轉歸情況，還需要進一步的實驗來證明。

3.4 以往對種子細胞的研究很多是由二維培養結果對三維構建特性進行推斷，這并不科學，因為細胞貼附的化學物理性質，細胞周圍培養基血清含量，接種密度等條件都不同。本實驗用鼠尾膠原作為支架構建三維培養，發現HEF比普通FB增殖更好，細胞功能更好，對支架的吸附性更好，體現了它良好的適應能力，驗證了以往文獻[6]。隨著培養時間的延長，兩組構建都表現出程度不同的收縮，并與細胞增殖具有時相性關系，即在細胞剛剛種植時，凝膠并未出現明顯的收縮，在細胞增殖最旺盛時，凝膠收縮最劇烈。膠原的收縮是由成纖維細胞伸出突起對膠原纖維施加牽拉張力，使膠原纖維重新排列所致[7]。本實驗中HEF增殖快，分泌旺盛，其三維構建表現出了更強的機械力學特性，收縮更加劇烈。

3.5 對三維構建培養液中細胞因子動態觀察，其目的在于觀察細胞的分泌特性，并間接了解種子細胞在鼠尾膠原中的存活和功能。IL-6是表皮細胞的一種絲裂原，可加速創面表皮化[8]。本實驗發現與普通FBs相比，HEF的IL-6分泌更加旺盛，兩組三維培養的IL-6含量上升趨勢與各組FBs數量增殖趨勢基本平行。TGF－β1參與創面愈合的全過程[9]，對細胞分化、免疫功能、細胞增殖、炎癥過程具有雙相調節作用，可促進膠原合成與成熟[10-11]，能夠刺激血管生成和上皮化，刺激FBs的增殖、分化，促進肉芽組織形成，導致瘢痕的產生[12]。本實驗發現HEFs的TGF-β1分泌量在各時相均少于普通成纖維細胞，且隨時間增加的幅度并不大，說明HEFs的TGF-β1一直處于低分泌水平，并不隨細胞數增加呈幾何倍數增長。

我們的研究表明HEF具有旺盛的繁殖能力和低免疫原性，在鼠尾膠原凝膠中保持著活躍的生物學特性，是理想的組織工程種子細胞。但創面愈合是一個復雜的過程，涉及到各種細胞間的相互作用、細胞與基質間的作用以及多種炎癥因子和細胞因子的作用，如何利用動物實驗進一步探索HEF組織工程皮膚的有效性和安全性以及其治療流程和機制，并建立HEF細胞庫，將其廣泛應用于臨床，是一個有深遠意義的研究課題。

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[收稿日期]2010-12-26[修回日期]2011-03-12

編輯/張惠娟