地塞米松及堿性成纖維細胞生長因子聯合應用防治超長任意型皮瓣缺血壞死的實驗研究

[摘要]目的：探討聯合應用地塞米松和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）對大鼠背部超長任意皮瓣成活的影響，并進一步探討大鼠血清中TNF-α及皮瓣中內皮細胞的細胞間粘附分子1（ICAM-1）發揮作用的機制。方法：采用大鼠背部皮瓣模型，術后即刻腹腔內一次性大劑量注射地塞米松，皮瓣下均勻滴注bFGF，術后24h內觀察TNF-α及ICAM-1的變化，術后7天觀察皮瓣成活率及組織學變化。結果：皮瓣成活率聯合用藥組（58.2±5.2）%＞bFGF組（50.5±3.9）%＞地塞米松組（48.7±4.2）%＞對照組（39.5±3.7）%，（F=32.08，P＜0.01）；聯合用藥組與地塞米松組較對照組及bFGF組血清中TNF-α含量達高峰時間更晚，峰值更低，且各組均于術后24h下降明顯；各組于術后4h皮瓣組織的上皮細胞、血管內皮細胞和成纖維細胞的胞漿中均呈現ICAM-1的mRNA表達，并均于術后8h呈現ICAM-1陽性蛋白表達高峰， 對照組及bFGF組明顯高于聯合用藥組和地塞米松組（P＜0.01），之后緩慢下降，術后12h仍保持較高水平。結論：地塞米松和bFGF均能促進皮瓣成活，且地塞米松+bFGF促進皮瓣成活優于單用地塞米松和單用bFGF。地塞米松能夠延遲血清中TNF-α達到峰值的時間，顯著降低其峰值含量，并通過抑制皮瓣中ICAM-1，干預炎癥反應起始過程，從而減輕皮瓣炎癥反應。

[關鍵詞]地塞米松；堿性成纖維細胞生長因子；皮瓣；缺血壞死；成活率；TNF-α；ICAM-1

[中圖分類號]R622[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2010）04-0591-04

Experimental study of the application that Dexamethasone combined with basic fibroblast growth factor(bFGF) to prevent ischemia and necrosis from ultra-long radom skin flap

LIN Jie，QIU Shu-lin

(Department of Plastic Surgery，Hebei People’S Hospital，Shijiazhuang 050051，Hebei，China)

Abstract:ObjectiveTo study the combined effects of Dexamethasone and basic fibroblast growth factor (bFGF) of the random flap survival on rat's dorsal， and further explore the levels of TNF-α in serum and how is the mechanism that the intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in endothelial cells of skin flap to play a role.MethodsThe rat dorsal skin flap model， a one-time immediately after high-dose intraperitoneal injection of Dexamethasone， drip bFGF equably under the flap， observed the changes of TNF-α and ICAM-1within 24h， post 7 days view the survival rate of the flap and histological changes. Results The survival rate of flap combined group (58.2 ± 5.2)%> bFGF group (50.5 ± 3.9)%> Dexamethasone group (48.7 ± 4.2)%> the control group (39.5 ± 3.7)%， (F = 32.08， P<0.01). The levels of TNF-α in serum of combined group and Dexamethasone group reached a peak time later than in the control group and bFGF group， and the peak is lower， and all groups were significantly decreased after 24h; each group 4 hours after surgery， epithelial cells of flap， endothelial cells and fibroblasts were present in the expression of mRNA of ICAM-1 in cytoplasm， and the positive expression peak of ICAM-1were presented at 8h after. In the control group and bFGF group was significantly higher than in the combination group and the Dexamethasone group (P<0.01)， followed by a slow decline， the level remained high after 12h. Conclusion The Dexamethasone and bFGF all can promote the flap's survival rate， and Dexamethasone + bFGF group is superior than Dexamethasone alone or bFGF alone. Dexamethasone could delayed the peak time of TNF-α in serum， significantly reduced the peak levels， and by inhibiting the ICAM-1 in the flap， interfere with initiation of inflammation， thus reducing the flap inflammation.

Key words: Dexamethasone; basic fibroblast growth factor(bFGF); flap; ischemia and necrosis; survival rate;TNF-α；ICAM-1

皮瓣缺血壞死是一種復雜的病理生理過程。伴隨隨意型皮瓣形成，皮瓣邊緣及基底部血供完全離斷，僅保留蒂部的血液供應，直接導致血管損傷，血小板聚集，皮瓣組織缺血、缺氧，同時發生白細胞粘附、游走，炎性因子釋放，氧自由基損害和鈣離子超載等病理變化，而炎癥的發生又進一步加重了皮瓣組織損傷。超長隨意型皮瓣由于超過了隨意型皮瓣長寬比例的最高限度（2:1），蒂部血液供應不能達到皮瓣遠段，使得皮瓣遠段組織長時間的缺血缺氧情況未得到改善，故其最終的結果是皮瓣遠段發生壞死。因此，皮瓣壞死防治的根本措施在于改善血液循環，減輕炎癥反應和防止或減輕缺血再灌注損傷。本研究試圖通過觀察應用地塞米松及堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）后大鼠皮瓣成活率、組織學等的變化，同時測定血清中TNF-α含量、皮瓣中ICAM-1含量，進一步了解聯合應用地塞米松及bFGF提高皮瓣成活率的可行性，以擴大任意皮瓣移植的應用范圍。

1材料和方法

1.1 動物來源及分組：健康Wistar大鼠（河北醫科大學動物實驗中心提供，體重280g±10g）96只，雌雄不限。大鼠背部超長任意皮瓣模型制備后，按術后即刻給藥不同，將大鼠隨機分為四組，即A組為對照組：腹腔注射生理鹽水0.2ml，皮瓣下滴注生理鹽水0.25ml；B組為地塞米松組：腹腔注射地塞米松0.2ml（用量為5mg/kg），皮瓣下滴注生理鹽水0.25ml；C組為bFGF組：腹腔注射生理鹽水0.2ml，皮瓣下滴注含1750IU bFGF的生理鹽水0.25ml（用量為155IU/cm2）；D組為地塞米松聯合bFGF組：腹腔注射地塞米松0.2ml，皮瓣下滴注含1750IU bFGF的生理鹽水0.25ml。

1.2 大鼠背部超長任意皮瓣模型制備：96只大鼠均以2%戊巴比妥鈉腹腔注射（35～40mg/kg）麻醉，麻醉滿意后，背部脫毛，俯臥位固定，碘酒、酒精消毒。于鼠背正中以髂嵴連線為基準線，以后正中線為軸線，掀起一7.5cm×1.5cm大小的任意皮瓣（含脂膜肌層，長寬比5:1），其蒂在尾部。3-0絲線原位縫合皮瓣，B、D組術后即刻一次性腹腔注射地塞米松，C、D組術后即刻于皮瓣下均勻滴注 bFGF。A組給予生理鹽水腹腔注射及皮瓣下滴注，時間方法同上。

1.3 觀測指標及方法：①皮瓣大體觀察：術后第7天對大鼠背部隨意皮瓣成活的情況進行肉眼觀察；②皮瓣成活率：壞死皮瓣以其外觀、顏色及質地來判斷，術后7天，用數碼相機進行皮瓣攝像，圖像輸入計算機，應用Image-Pro Plus.v6.0圖像分析系統，計算出皮瓣成活率（即皮瓣成活面積與總面積之比）；③組織學檢查：術后3天和7天各組均于皮瓣中段取 0.5cm×0.2cm全厚皮瓣組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片、HE染色；a) 光鏡下觀察組織結構改變；b)進行毛細血管計數，血管計數方法：所有血管均計數在內，每組5張切片，每張切片在中央區及周邊區隨機選取5個高倍視野，血管計數后求其平均數；c) 進行成纖維細胞計數：每組5張切片，每張切片在中央區及周邊區隨機選取5個高倍視野，成纖維細胞計數后求其平均數；④ 檢測血清中TNF-α含量：各組分別于術后0h、1h、4h、8h、12h、24h心臟取血，離心后取血清，用雙抗體夾心ELISA法測定TNF-α含量；⑤細胞間粘附分子1（ICAM-1）免疫組化染色切片：術后4h、8h、12h各組均于皮瓣中段取 0.5cm×0.2cm全厚皮瓣組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，免疫組化染色，光鏡觀察ICAM-1的分布部位和表達；每張切片選取有代表性的區域，隨機取5個互不重疊的400倍視野，以光密度200為背底，光鏡顯微照相機取圖，應用Image-Pro Plus.v6.0圖像分析系統進行定量分析，測量陽性目標累積光密度值（integrated optical density，IOD），并用計算機進行統計學處理；⑥統計學處理：整理各類數據并應用SPSS 13.0軟件對數據進行處理。

2實驗結果

2.1 皮瓣大體觀察：術后7天，D組皮瓣近段顏色淡紅，彈性好，并可見少量毛發生長；中段中間區顏色由近向遠淡紅色逐漸變暗，表面無痂殼形成，無毛發生長，邊緣區顏色發黑并有少量痂殼覆蓋，彈性減退；遠段顏色發黑，表面有痂殼，彈性差。原位掀起皮瓣時見皮瓣出血活躍，出血量較多；肉膜下無積血積液，血管豐富。C組：皮瓣表面肉眼觀與地塞米松組近似，皮膚彈性略好于地塞米松組，原位掀起皮瓣時可見肉膜下較薄一層淡紅色新鮮肉芽組織，出血活躍，出血量較多，亦可見少量炎性滲出液。B組：皮瓣近段顏色淡紅，彈性較好，少見毛發生長；中段顏色逐漸變暗，表面有部分黑色痂殼形成，無毛發生長，彈性較差；遠段顏色發黑，痂殼較厚，彈性極差。原位掀起皮瓣時見肉膜下可見少量新鮮出血及少量滲出液。A組：皮瓣近段顏色淡紅，由近向遠顏色變暗，皮瓣蒂部可見少量毛發生長；中段及遠段顏色發黑，表面有痂殼形成，彈性極差，原位掀起皮瓣時見皮瓣出血較少，肉膜下炎性分泌物較多，血管相對稀疏。根據觀察結果，各實驗組皮瓣中遠段成活情況均明顯好于A組；D組皮瓣中遠段成活情況略好于C組和B組。

2.2 皮瓣成活率：術后7天皮瓣成活率，D組﹥C組﹥B組﹥A組，四組有非常顯著性差異（F=32.08，P﹤0.01）。兩兩比較，B、C組間無顯著性差異（P﹥0.05），其他各組間均有顯著性差異（P﹤0.01）。（見表1）

2.3 HE染色光鏡組織學觀察

2.3.1 術后3天，D組：表皮及真皮各層結構無明顯改變，皮下組織輕度水腫，血管擴張、充血，無明顯嗜中性粒細胞浸潤，成纖維細胞增生，肌纖維排列規則、緊密；C組：表皮及真皮細胞排列較規則，皮下組織水腫，血管擴張、充血明顯，可見嗜中性粒細胞浸潤，成纖維細胞大量增生，肌纖維排列較規則、結構緊密；B組：表皮及真皮細胞排列較規則，皮下組織水腫，血管擴張、充血，可見少量嗜中性粒細胞浸潤， 肌纖維排列較規則、結構松散；A組：局限性表皮變薄，皮下組織水腫較重，血管擴張、充血，可見嗜中性粒細胞浸潤，肌纖維排列紊亂、結構松散。術后7天，D組：表皮萎縮不明顯，皮膚各層結構無明顯改變，復層上皮細胞排列整齊；皮下組織輕度水腫，血管輕度擴張；可見散在的局灶性嗜中性粒細胞浸潤；真皮和真皮下層新生小血管生長活躍，皮下纖維組織增生明顯，纖維排列較規則。C組：局限性表皮萎縮、變薄、破潰；皮下組織水腫，血管擴張，有少許皮下出血；嗜中性粒細胞浸潤明顯；真皮和真皮下層可見新生小血管，皮下纖維組織增生，纖維排列較規則。B組：表皮破損，真皮層細胞排列較紊亂；皮下組織水腫，血管擴張，并有散在皮下出血；有明顯的嗜中性粒細胞浸潤；真皮和真皮下層可見少量新生小血管，肌組織松散，纖維排列較規則。A組：表皮及真皮完全壞死；結構混亂不清；大量的嗜中性粒細胞浸潤；肌纖維壞死明顯。

2.3.2 毛細血管計數：術后3天，D組（7.4±0.55）個﹥C組（6.8±1.09）個﹥B組（4.6±0.55）個﹥A組（3.2±0.84）個，四組有非常顯著性差異（F=32.40，P﹤0.01）。兩兩比較，D、C組間無顯著性差異（P﹥0.05），其他各組間均有顯著性差異（P﹤0.01）。術后7天，D組（7.0±0.71）個﹥C組（3.8±1.09）個﹥B組（2.6±0.55）個﹥A組（0.4±0.55）個，四組有非常顯著性差異（F=65.94，P﹤0.01）。兩兩比較各組間均有顯著性差異，其中B、C組間比較P﹤0.05，其他各組間比較P﹤0.01。

2.3.3 成纖維細胞計數：術后3天，D組（27.8±3.56）個﹥C組（26.4±3.21）個﹥B組（11.8±2.86）個﹥A組（11.2±2.39）個，四組有非常顯著性差異（F=44.18，P﹤0.01）。兩兩比較，D、C組成纖維細胞數量明顯多于B、A組，差異顯著（P﹤0.01）；D、C組間比較，B、A組間比較，均無顯著性差異（P﹥0.05）。術后7天，D組（48.2±7.33）個﹥ C組（23.6±4.45）個﹥B組（15.0±1.87）個﹥A組（0.6±0.89）個，四組有非常顯著性差異（F=102.47，P﹤0.01）。且兩兩比較各組間有顯著性差異（P﹤0.01）。

2.4 血清中TNF-α含量：術后0h、1h、4h、8h、12h、24h血清中TNF-α含量統計結果（圖1）顯示，A、C組于術后4h TNF-α的濃度達到高峰，然后逐漸下降，于術后24h下降明顯；B、D組，于術后8h TNF-α的濃度達到高峰，亦于術后24h下降明顯。各組峰值統計結果顯示，B、D組明顯低于A、C組，差異顯著P﹤0.01。

2.5 ICAM-1在皮瓣中表達的免疫組織化學變化：術后4h，A、C組皮瓣組織的上皮細胞、血管內皮細胞和成纖維細胞的胞漿中均呈現陽性表達，且表達量較多，呈散在性分布；B、D組在上皮細胞、血管內皮細胞和成纖維細胞胞漿中的表達呈弱陽性，表達量很少，呈散在性局灶性分布。術后8h，各組均呈現ICAM-1陽性蛋白表達高峰，A、C組皮瓣上皮細胞、血管內皮細胞和成纖維細胞的胞漿中呈強陽性表達，可見大量棕褐色陽性顆粒分布，B、D組陽性表達也明顯增強，染色呈棕黃色，散在分布。術后12h，各組表達均有所下降，其中B、D組下降明顯，但尚未恢復至術后4h水平，A、C組隨較術后8h表達有所下降，但仍保持較高水平。術后4h、8h、12h測量 ICAM-1陽性目標累積光密度值統計結果（圖2）顯示，術后8h，各組均呈現ICAM-1陽性蛋白表達高峰，四組峰值有非常顯著性差異（F=224.30，P﹤0.01），兩兩比較，A、C組明顯高于B、D組（P﹤0.01）。

3討論

皮瓣在缺血壞死過程中活化大量的中性粒細胞，活化過程中產生大量氧自由基，Ca2+超載，并分泌大量炎性細胞因子如：TNF-α、IL-1、IL-8等，造成內皮細胞破壞，中性粒細胞活化后還會經歷與內皮細胞粘附，浸潤到組織，中性粒細胞與內皮細胞的粘附可引起血管的持續性收縮，引起組織的低灌注，這也是造成缺血-再灌注損傷的原因，最終導致死亡。而粘附始于內皮細胞的細胞間粘附分子1（ICAM-1）與白細胞受體的結合。本研究免疫組化染色結果證實：應用地塞米松能夠抑制上皮細胞、血管內皮細胞和成纖維細胞胞漿中ICAM-1陽性蛋白的表達，有效的抑制了ICAM-1與白細胞受體的結合，從而減少中性粒細胞與內皮細胞的粘附，減輕皮瓣炎癥反應。本實驗中另一結果顯示：地塞米松可以抑制中性粒細胞活化過程釋放炎性細胞因子TNF-α，從而減輕皮瓣的炎癥反應。術后即刻起手術應激導致血液中TNF-α濃度增高，隨后逐漸增高，應用地塞米松可以延遲其峰值濃度出現時間，并有效降低其峰值，隨后血清中TNF-α濃度下降，各組均于術后24h明顯下降，且低于術后即刻水平。這提示我們臨床應用地塞米松應愈早愈好，本實驗進一步證實了地塞米松給藥時間的選擇應在TNF-α高峰出現前抑制其釋放，即術后4h前盡早給藥可以達到最佳效果。本實驗于術后即刻一次性大劑量（5mg/kg）給予地塞米松腹腔注射可以有效減輕皮瓣炎癥反應又避免了糖皮質激素副作用的發生。

缺血皮瓣與受床及傷口邊緣組織間微循環重建直接影響缺血組織的存活。bFGF是一種廣譜的有絲分裂原，具有廣泛的細胞增殖效應。動物實驗發現它能促進各種組織和器官內的血管再生，可顯著增強內皮細胞粘附遷移、分裂增殖，促進血管新生，加速創傷愈合[1-3]，也促進組織細胞本身的分裂增殖，誘導周圍毛細血管向其內部的長入，尤其能促進內皮細胞分裂，這種作用可能通過上調VEGF (血管內皮生長因子)表達，誘導其分泌某些蛋白酸，溶解并侵入周圍基質，進而形成毛細血管[4-6]。這種促血管生成作用有可能使皮瓣在移植后較早期與受體建立血管網。本實驗結果也證實了bFGF有促進隨意皮瓣成活的作用，光鏡病理組織觀察結果顯示：應用bFGF組真皮及真皮下組織新生小血管生長活躍，皮下肌纖維組織增生明顯，結構排列整齊。且聯合應用地塞米松及bFGF組毛細血管數和成纖維細胞數均顯著多于bFGF組（P﹤0.01），表明地塞米松能夠增強bFGF的促血管內皮細胞和成纖維細胞生成作用。

本實驗研究根據兩種藥物促進皮瓣成活機理不同，將地塞米松與bFGF兩種

藥物聯合應用促進皮瓣成活的效果更佳。其發揮協同作用的機理仍有待進一步研究。

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[收稿日期]2010-10-12 [修回日期]2010-12-21

編輯/張惠娟