血管緊張素Ⅱ對創傷愈合中成纖維細胞增殖影響的研究

[摘要]目的：探討血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）對創面愈合中成纖維細胞增殖的影響及不同濃度AngⅡ對創面作用的差異。方法：采用不同濃度AngⅡ作用于小鼠新鮮創面，應用流式細胞儀檢測相同面積創面中S（DNA合成期）期成纖維細胞所占的比例。結果：與對照組相比，AngⅡ可有效促進創面中成纖維細胞的增殖，從而促進創面肉芽組織生長，使創面愈合加快。結論：AngⅡ可促使局部創面成纖維細胞增殖，從而加快創面愈合，且呈濃度依賴性。

[關鍵詞]成纖維細胞；血管緊張素Ⅱ；創面愈合

[中圖分類號]R619 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）04-0602-03

Effects of angiotensin Ⅱ on proliferation of fibroblast in wound healing

HAN Xi-li，LI Hong-guang，ZHANG Bao-lin

(The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China )

Abstract:Objective To study the effects of angiotensinⅡ（AngⅡ）on accelerating proliferation of fibroblast in wound healing and the difference of AngⅡ of different concentrations in different wounds. Methods AngⅡ of different magnitude concentrations effect on the fresh wounds of mice， then the flow cytometry detects the proportion of S（ DNA synthesis）phase fibroblasts of wounds in the same area.ResultsCompared with the control group， AngⅡ can effectively promote the proliferation of fibroblasts in wound healing， thus contribute to the growth of granulation， so that the wounds heal much faster. Conclusion AngⅡ can promote the fibroblast's proliferation， thus speeding up the rate of wound healing，and the wounds healed with AngⅡ dose-dependently.

Key words:fibroblasts; angiotensin Ⅱ; wound healing

創傷修復過程由細胞、細胞因子、細胞外基質等共同參與完成，并在機體調控下呈現高度有序性、完整性和網絡性。創傷愈合的主要病理表現為瘢痕修復，而瘢痕的主要成分是增殖的成纖維細胞和細胞外基質的積聚，其機制尚未完全闡明。目前研究證明，細胞因子在創傷愈合中起著重要作用。AngⅡ是腎素一血管緊張素系統(rennin-angiotensin system，RAS)主要的生物活性肽。多年來，人們都習慣認為AngⅡ只是一種血管活性物質。然而，近年來已有越來越多的研究顯示AngⅡ 還是一種多效應生長因子影響細胞的增殖、分化和凋亡，并在組織損傷修復和纖維化中起重要作用[1]。因此，我們推測AngⅡ可作用于局部創面而促進創面的愈合。通過觀察在創傷愈合過程中高劑量組、中劑量組、低劑量組以及對照組皮膚全層缺損致傷模型傷口愈合的情況，利用熒光染料碘化吡啶（propidium iodide，PI）作為DNA的鑒定標志物，應用流式細胞儀檢測合成器細胞所占比例，研究不同濃度的AngⅡ對創傷愈合過程中成纖維細胞增殖的影響，為AngⅡ作為一種促進創面的愈合藥應用于臨床提供理論依據。

1材料和方法

1.1 實驗用動物：SD雄性大鼠10只，體重175～200g，由山西醫科大學生理教研室動物中心提供。

1.2 實驗材料及主要儀器：血管緊張素Ⅱ、碘化吡啶（PI）、胰蛋白酶、脫氧核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）： 美國Sigma公司；磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer solution，PBS）：北京中山生物公司；流式細胞儀；普通光學顯微鏡；低溫離心機。

1.3動物全層皮膚缺損模型制備：所有實驗鼠單籠喂養，自由飲水與攝食。實驗當日禁食，麻醉后背部凈毛；碘伏消毒，在脊柱兩側各旁1.0cm處以專用打孔器致傷，4個圓形創面，每個創面直徑1.5cm，深至皮下。

1.4 動物分組與給藥：將10只SD大鼠共40個創面，每只四個創面隨機應用：①NS陰性對照組；②1×10-9mol/ml AngⅡ（低劑量）組；③1×10-8mol/ml AngⅡ（中劑量）組；④1×10-7 mol/ml AngⅡ（高劑量）組。每個創面按分組分別滴加相應濃度物質0.2ml，粘性媒介羧甲基纖維素、無菌紗布包扎，此后換藥1次/日，直至傷后第5天的取樣分析。

1.5 全層皮膚組織細胞周期及DNA含量分析：傷后第5天于每個創面邊緣（創面與正常組織交界處）取1.0cm×1.0cm大小皮膚組織，去除皮下脂肪，剪碎，經篩網過濾、胰蛋白酶消化，加入PBS緩沖液，制成單細胞懸液。酒精固定，4℃下過夜，光學顯微鏡下將細胞濃度稀釋到約106個/ml。加入RNase在37℃溫箱30min，避光加入DNA特異性染料PI于0℃～4℃下避光染色1h，經流式細胞儀測每個樣品中S期細胞所占比例。

1.6 統計學分析：采用SPSS13.0統計軟件進行分析，所有數據用x±s表示， P<0.0 5有統計學意義。

2結果

2.1 大體觀察所見：致傷后5天，AngⅡ組創面出現較明顯的肉芽組織，NS組肉芽組織較少。

2.2 創面面積測量結果：NS組、低劑量組、中劑量組和高劑量組創面面積在傷后3天即縮小，傷后5天時NS組創面面積為初始面積的95.51%，低劑量組創面面積為初始面積的92.81%左右，中劑量組創面面積為初始面積的91.82%左右，高劑量組創面為初始面積的89.88%左右。傷后5 天的各用藥組和對照組創面收縮程度比較(P<0.05)，且各用藥組間比較亦(P<0.05)。見表 1。

2.3 全層皮膚組織細胞周期及DNA含量測定結果：應用AngⅡ各組的全厚層皮膚組織的細胞中S期細胞百分比高于NS對照組(P<0.05)，且AngⅡ各組間(P<0.05)。見表2、圖1。

3討論

成纖維細胞是創傷愈合過程中主要的修復細胞之一，它與細胞外基質的形成、肉芽組織的形成有密切的關系[2]。創面修復包括真皮的修復，修復過程中所形成的結締組織主要成分是成纖維細胞及其產生的膠原蛋白，創傷組織膠原合成的好壞，直接影響到傷口愈合的速度與質量[3]。膠原是皮膚的主要結構蛋白，由成纖維細胞合成與分泌。而創面愈合過程中膠原合成、分泌與沉積的量的增加，并不是借助于成纖維細胞內膠原mRNA表達的增強，而是借助于成纖維細胞的增殖，使其細胞數量顯著增加，從而實現膠原合成、分泌與沉積的增加，填充創傷所致的皮膚缺損，這也是創面愈合過程中成纖維細胞增殖的真正目的。在創面修復的全過程中成纖維細胞的活動規律是傷后第4～7天成纖維細胞開始增殖，第6天后開始合成膠原蛋白，而且成纖維細胞增殖與膠原合成以傷后7～14天最快，隨后繼續增殖并合成大量膠原蛋白，使創面得以填充而迅速愈合[4]。

AngⅡ是RAS中最重要的效應肽，被認為是一個應激激素，在維持血壓和水電解質平衡中起重要作用。近年來研究發現局部組織中存在AngⅡ，它在組織損傷修復及纖維化中發揮重要作用[5-7]。AngⅡ1型受體(AngiotensinⅡtype 1 respector，AT1R)組織分布廣泛，且在整個生命期均有表達，在靶器官，AT1調節AngⅡ的絕大部分作用，如細胞生長、細胞外基質沉積等。2型受體(AngiotensinⅡtype 2 respector， AT2R)在胚胎期廣泛表達，出生后迅速下降，維持在一個很低的水平，在某些病理情況下(如血管損傷、皮膚損傷等) AT2R的表達明顯升高。最近國外學者報道了獨立于血漿源性的Ang系統，即皮膚組織存在AngⅡ及其受體，皮膚的角質形成細胞能夠合成AngⅡ[1]。國內最近也報道了人皮膚角質形成細胞表達血管緊張素轉化酶(Angiotensin-con verting enzyme，ACE)，在增生性瘢痕中ACE的表達強度和AngⅡ產生明顯增加[8]，提示AngⅡ可能在創傷愈合過程中發揮作用，然而AngⅡ局部應用促進創面愈合中成纖維細胞的分裂、增殖未見文獻報道。

本研究采用流式細胞儀測定法證實AngⅡ局部應用可促進創面中成纖維細胞的分裂、增殖而達到愈合目的，且隨AngⅡ濃度的升高，處于S期的成纖維細胞所占比例越大，峰值出現也越早。本研究有可能為AngⅡ在臨床創面愈合的應用提供理論依據。但AngⅡ最適濃度及應用時間還不清楚，仍需進一步深入研究。

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[收稿日期]2010-10-26 [修回日期]2011-02-10

編輯/張惠娟