綠色熒光標(biāo)記共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞體內(nèi)\\外培養(yǎng)觀察

[摘要]目的：對Wistar大鼠睪丸間質(zhì)體細(xì)胞轉(zhuǎn)染攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒，為進(jìn)一步標(biāo)記睪丸間質(zhì)體細(xì)胞移植組織工程實驗奠定基礎(chǔ)。方法：獲取Wistar大鼠睪丸間質(zhì)體細(xì)胞，用慢病毒轉(zhuǎn)載綠色熒光對其轉(zhuǎn)染標(biāo)記，體外培養(yǎng)，在共聚焦熒光顯微鏡下動態(tài)觀察細(xì)胞生長、增殖等情況。回植于去勢鼠體內(nèi)，培養(yǎng)一定時期后取心臟血進(jìn)行雄激素的檢測。結(jié)果：睪丸間質(zhì)體細(xì)胞于90h后，在熒光顯微鏡藍(lán)光激發(fā)波長下，可發(fā)出明亮的綠色熒光，轉(zhuǎn)染率達(dá)80%。傳代后的細(xì)胞仍能發(fā)出明亮的綠色熒光。回植后血清學(xué)檢測有明顯高于對照組的激素檢出。結(jié)論：經(jīng)GFP轉(zhuǎn)染后的睪丸間質(zhì)體細(xì)胞仍具有睪丸間質(zhì)體細(xì)胞的特性。采用攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒標(biāo)記睪丸體細(xì)胞中梭形及不規(guī)則形細(xì)胞（SLCs等）轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率高且持久、簡便有效，且能保持睪丸間質(zhì)體細(xì)胞原有生物學(xué)特性。

[關(guān)鍵詞]綠色熒光；共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞；細(xì)胞標(biāo)記

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）04-0608-05

Detection of the culture in vitro of the co-cultured testis somatic cells and GFP labeling

LI Ming1，XU Feng2，XU Hong-xia1，WANG Xiao-yun3，F(xiàn)AN Xing4，BI Hong-da3，XING Xin3

(1.Department of Plastic Surgery， Navy General Hospital，Beijing100037，China;2.Nuclear of Shanghai Ninth People's Hospital Affiliated Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200011，China;3.Department of Plastic Surgery，Changhai Hospital Affiliated The Second Military Medical University Shanghai 200433，China;4. The Institute of Plastic Surgery，PLA of The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveGreen fluorescent protein(GFP) are nanoparticles which have strong fluorescence intensity and more are resistant to photobleaching thanorganic fluorescence probes in cell biology and biomedicine. In this report， we labeled it with GFP for the co-cultured testis somatic cells.MethodsWe got seed-cells labeling with GFP. We cultured the labeled cells and went down to the future generation. We observed it by the micrscope. Assay the serum testeosterone level of the transplanted rats by heart puncture.ResultsThe co-cultured testis somatic cells labeled with GFP were easy to label. The GFP in the cells were brighter， more stable. The GFP in the cells were inherited by the daughter cells. Conclusion GFP labeling opened up new possibilities for monitoring of the co-cultured testis somatic cells. Especially for stem Leydig cells， SLC， Progenitor Leydig cells， PLC. And can remain its proper biological characteristics

Key words: green fluorescent protein (GFP); the co-cultured testis somatic cells; cell labeling

新興的組織工程技術(shù)為組織、器官缺損及激素分泌下降等方面的患者帶來了希望和福音。組織工程技術(shù)，其基本原理是將少量種子細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后與生物載體結(jié)合，在體內(nèi)或體外構(gòu)建具有一定形態(tài)和生理功能的組織甚至器官。要了解作為種子細(xì)胞的睪丸間質(zhì)體細(xì)胞移植后在體內(nèi)的生物學(xué)行為（如遷移定植、分布、增殖、分化和激素的分泌等），離不開睪丸間質(zhì)體細(xì)胞的示蹤和定量技術(shù)。傳統(tǒng)的標(biāo)記方法隨著標(biāo)記時間的延長和細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，標(biāo)記物會逐漸減弱甚至消失，不利于移植細(xì)胞的示蹤和細(xì)胞分化的研究。綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein)在紫外光或藍(lán)光激發(fā)光下可自發(fā)地發(fā)射內(nèi)部綠色熒光，在普通顯微鏡下即可觀察出[1-2]。綠色熒光蛋白標(biāo)記具有表達(dá)穩(wěn)定、方便檢測及不影響細(xì)胞功能等優(yōu)點。從而被廣泛地應(yīng)用于示蹤移植干細(xì)胞在體內(nèi)的定植、分布、含量、分化及轉(zhuǎn)歸等方面的研究[3-4]。在前期研究中，依據(jù)Leydig細(xì)胞貼壁迅速的特性建立了一種簡易快速的Leydig細(xì)胞分離技術(shù)[5]。后又經(jīng)研究用差速貼壁法獲取睪丸間質(zhì)細(xì)胞。近期有研究表明經(jīng)差速貼壁法獲得的睪丸間質(zhì)體細(xì)胞群中含有Leydig干細(xì)胞（Stem Leydig cells，SLCs）、前體細(xì)胞（Progenitor Leydig cells， PLC）及成熟的Leydig細(xì)胞，前體細(xì)胞向LC定向分化后，開始特征性表達(dá)3β-羥類固醇脫氫酶（3β-HSD），但其增殖能力逐漸降低，至成熟LC時已完全喪失有絲分裂能力。因此，干細(xì)胞和前體細(xì)胞是成熟LC生理性更新的重要來源[6-9]。使得睪丸間質(zhì)體細(xì)胞具有激素分泌及分化潛能，SLCs在體外培養(yǎng)過程中逐漸分化成成熟Leydig細(xì)胞，實現(xiàn)激素可持續(xù)性分泌[10]。是雄激素分泌組織工程構(gòu)建的理想種子細(xì)胞。本實驗通過攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)體細(xì)胞，為進(jìn)一步標(biāo)記睪丸間質(zhì)體細(xì)胞移植組織工程實驗奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料及試劑

1.1.1實驗動物：3周齡、體重50～56g雄性近交系同基因wistar大鼠，中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供。

1.1.2試劑和藥品：DMEM/F12(1:1)購自Gibco公司；胎牛血清（FCS）購自（美國，Hyclone）；攜帶GFP的慢病毒(第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院朱吉博士惠贈)；胰蛋白酶、胎牛血清等其它化學(xué)用品(購自美國Sigma公司)；倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS)；CO2孵箱 (美國，F(xiàn)orma)。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)及GFP標(biāo)記

1.2.1 Wistar大鼠睪丸間質(zhì)體細(xì)胞的分離及培養(yǎng)：無菌條件下切取3周齡wistar大鼠的睪丸組織，去除白膜，和可見血管，將睪丸組織剪碎，0.3%復(fù)合膠原酶NB4與組織量按5:1比例，于37℃恒溫?fù)u床內(nèi)消化至睪丸形狀基本消失，曲細(xì)精管斷裂，加兩倍量的PBS稀釋。經(jīng)150目濾網(wǎng)過濾，1 500r/min離心5min，沉淀細(xì)胞，37℃、5%CO2、95%O2和100%濕度條件下，無血清DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)24h，沖洗去除懸浮細(xì)胞，所得全部貼壁細(xì)胞即為共培養(yǎng)睪丸體細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與生長情況。待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底，即可用0.25%胰蛋白酶消化，注意控制消化時間不超過2min，接著進(jìn)行傳代。

1.2.2 Wistar大鼠睪丸間質(zhì)體細(xì)胞的GFP轉(zhuǎn)染即慢病毒GFP轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)體細(xì)胞：將培養(yǎng)的睪丸體細(xì)胞以0.25%胰酶蛋白酶-0.02%EDTA消化，制備單細(xì)胞懸液。將病毒液小心滴加之細(xì)胞上，輕輕混勻。置于37℃，5% CO2、95%O2和100%濕度培養(yǎng)箱中孵育4h，離心，棄去轉(zhuǎn)染液，將細(xì)胞按2.5×106的密度進(jìn)行接種于經(jīng)0.1%明膠包被的新培養(yǎng)皿內(nèi)，加2ml加有血清DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～90h。熒光倒置顯微鏡觀察、拍照，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.3標(biāo)記后的睪丸間質(zhì)體細(xì)胞回植：將轉(zhuǎn)染標(biāo)記好的睪丸間質(zhì)共培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)合于生物材料支架上回植于去勢鼠（事先制備并飼養(yǎng)一定周期）體內(nèi)，進(jìn)行一定時間的體內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 雄激素的檢測：抽取回植了轉(zhuǎn)染了GFP的睪丸間質(zhì)體細(xì)胞的去勢鼠的血液，離心后取用血清，經(jīng)Access全自動免疫分析系統(tǒng)(RIA，微粒子發(fā)光原理)(Beckman C0ulter，USA)測定睪酮水平。

2結(jié)果

2.1 Wistar大鼠睪丸間質(zhì)體細(xì)胞的GFP轉(zhuǎn)染：原代培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中LC呈長梭形或是圓形，核大，胞質(zhì)少，類似石榴籽狀。SC呈長柱狀或三角形，有突起，折光性強。LC干細(xì)胞呈紡錘形、梭形或不規(guī)則形；慢病毒轉(zhuǎn)染后的共培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞中成熟的LC逐漸減少，反之梭形、不規(guī)則形，中間折光性強的細(xì)胞比例相對增大(圖3)。選擇激發(fā)波長為488nm、發(fā)射波長507nm熒光顯微鏡下，GFP轉(zhuǎn)染48h、72h、90h后的共培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的干細(xì)胞均貼壁生長良好，折光性好，呈紡錘型、梭型或不規(guī)則形，細(xì)胞膜光滑完整，胞質(zhì)豐富，核輪廓清晰，細(xì)胞增殖速度無明顯改變；而圓形，核大，胞質(zhì)少，類似石榴籽狀的LC細(xì)胞進(jìn)一步減少，崩解。熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)染48h可觀察到熒光表達(dá)，但強度稍弱（圖2）；72h后熒光顯微鏡下可見細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)，開始發(fā)出較強的翠綠色熒光（圖4）。90h后大多數(shù)細(xì)胞發(fā)出明顯綠色熒光，呈“全細(xì)胞型”，即胞質(zhì)和胞核彌漫性分布，表達(dá)強者，熒光呈翠綠色，有的區(qū)域可見數(shù)個聚集在一起的熒光細(xì)胞(圖5)。傳代后仍然是以梭形及不規(guī)則形細(xì)胞貼壁生長良好，而圓形類石榴籽狀細(xì)胞較少且不健康，要么處于凋亡中（圖6）。未轉(zhuǎn)染GFP的對照組細(xì)胞未見綠色熒光。收集轉(zhuǎn)染標(biāo)記好的睪丸間質(zhì)共培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)合于生物材料支架上，細(xì)胞濃集后發(fā)出翠綠色熒光，可間接通過回植時散落的細(xì)胞團(tuán)觀察(圖7)。

2.2 Wistar大鼠睪丸間質(zhì)體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率：隨機計數(shù)4個低倍視野中顯微鏡及轉(zhuǎn)換熒光觀察的同一視野中的細(xì)胞數(shù)量，計算90h熒光轉(zhuǎn)染效率為80%。

2.3標(biāo)記后的睪丸間質(zhì)體細(xì)胞回植：回植后實驗鼠成活良好，進(jìn)食、睡眠等如常，未觀察到死亡或其它異常行為。

2.4 血清學(xué)檢測：血清學(xué)檢測仍有明顯高于空白對照回植的雄激素表達(dá)。

3討論

3.1 GFP基因轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)體細(xì)胞的示蹤作用：GFP是從水母中分離出來的一種具有自發(fā)熒光的小分子蛋白質(zhì)[11]，具有性質(zhì)穩(wěn)定、易于構(gòu)建融合蛋白且融合蛋白仍能保持熒光活性、易于檢測、檢出率高和無細(xì)胞毒性等優(yōu)點。因此已成為檢測體內(nèi)基因表達(dá)及失蹤完整活細(xì)胞生命現(xiàn)象的重要標(biāo)記物，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用日益廣泛[12]。本實驗希望用GFP標(biāo)記目的細(xì)胞--睪丸間質(zhì)體細(xì)胞。前期實驗證明睪丸間質(zhì)體細(xì)胞共培養(yǎng)能提供一個由細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子及細(xì)胞間的相互接觸形成的穩(wěn)定的組織微環(huán)境，這對發(fā)育階段Leydig細(xì)胞數(shù)量和功能維持都具有重要支持和調(diào)節(jié)作用[13]，而成熟Leydig細(xì)胞分泌雄激素是主要的功能細(xì)胞。許多研究證實，成熟的LC為終末分化細(xì)胞，不具備有絲分裂能力，其在體數(shù)量的維持主要依靠LC的干細(xì)胞（stem Leydig cells， SLC）及前體細(xì)胞（Progenitor Leydig cells， PLC）[6-9]。并且有實驗證明差速貼壁法獲得的7天齡、3周齡大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞群中均含有Leydig干細(xì)胞（Stem Leydig cells，SLCs）SLCs在體外培養(yǎng)過程中逐漸分化，表達(dá)3β-羥基類固醇脫氫酶，并產(chǎn)生睪酮[10]。睪丸間質(zhì)體細(xì)胞群中含有Leydig干細(xì)胞（Stem Leydig cells，SLCs）及成熟的Leydig細(xì)胞，使得睪丸間質(zhì)體細(xì)胞具有激素分泌及分化潛能，SLCs在體外培養(yǎng)過程中逐漸分化成成熟Leydig細(xì)胞，實現(xiàn)激素可持續(xù)性分泌。對于構(gòu)建一塊能回植于體內(nèi)、可持續(xù)地分泌雄激素的組織來說意義深遠(yuǎn)。為此，本實驗應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)將GFP基因轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)體細(xì)胞，使其攜帶示蹤標(biāo)記。并將標(biāo)記好的細(xì)胞附著于一定材料的復(fù)合物上回植于事先制備好并培養(yǎng)一定時期的去勢鼠體內(nèi)。通過檢測其生物學(xué)特性、轉(zhuǎn)染率以便了解其轉(zhuǎn)染后的功能與轉(zhuǎn)歸。標(biāo)記成功與否以細(xì)胞是否發(fā)出翠綠色熒光為準(zhǔn)，同期通過空白對照排除其它因素引出的非轉(zhuǎn)染造成的熒光。收集轉(zhuǎn)染GFP基因的睪丸間質(zhì)細(xì)胞回植入體內(nèi)時培養(yǎng)皿散落的細(xì)胞團(tuán)，可見翠綠色細(xì)胞團(tuán)，由于細(xì)胞團(tuán)呈立體球形，鏡下只能清晰地看到某一層面的細(xì)胞。其余模糊的綠色也是轉(zhuǎn)染GFP的細(xì)胞，說明經(jīng)過收集、離心等過程的操作，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞性能穩(wěn)定，仍具較強的綠色熒光。更進(jìn)一步說明回植入體內(nèi)的細(xì)胞為標(biāo)記綠色熒光后的大鼠睪丸間質(zhì)共培養(yǎng)細(xì)胞。激素檢測轉(zhuǎn)染GFP后的睪丸間質(zhì)體細(xì)胞回植鼠的血清，有明顯高于對照組的激素檢出，說明經(jīng)GFP轉(zhuǎn)染后的睪丸間質(zhì)體細(xì)胞仍具有睪丸間質(zhì)體細(xì)胞的特性，GFP基因并未影響其中相關(guān)細(xì)胞激素的分泌。而在GFP轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)體細(xì)胞結(jié)果說明說明在睪丸間質(zhì)體細(xì)胞中的梭形細(xì)胞（SLCs等）轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率高且持久。但對于鋪展開的呈石榴籽狀的細(xì)胞即成熟的LC則不能標(biāo)記，且有使細(xì)胞崩解，凋亡的作用。

3.2 本實驗中慢病毒載體的優(yōu)、缺點：本實驗以原代培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)體細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因標(biāo)記研究，采用慢病毒載體實現(xiàn)了外源性基因的轉(zhuǎn)染，提示GFP基因已經(jīng)轉(zhuǎn)染到睪丸間質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)，并有效表達(dá)。實驗觀察到GFP成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞多為梭形的未完全分化成熟的細(xì)胞，而成熟的鋪展開的呈石榴籽狀的細(xì)胞則崩解，凋亡。我們將標(biāo)記好GFP的種子細(xì)胞回植于體內(nèi)，回植后實驗鼠成活良好，進(jìn)食、睡眠等如常，未觀察到死亡或其它異常行為，從血清學(xué)檢測中發(fā)現(xiàn)有高于空白對照組的激素分泌。說明，慢病毒載體在某種程度上會損傷發(fā)育成熟的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，但對未發(fā)育成熟的細(xì)胞不但不影響它的分化、還能成功標(biāo)記。我們使用GFP作為標(biāo)記基因，相應(yīng)的編碼蛋白能在熒光顯微鏡下顯示特異性的熒光，由此作為確定基因轉(zhuǎn)染成功與否的根據(jù)。所以相對其他標(biāo)記研究方法，本實驗操作更簡便，一旦標(biāo)記成功性狀穩(wěn)定，更能直觀的觀察實驗結(jié)果。但存在選擇性標(biāo)記（成熟的睪丸細(xì)胞無法標(biāo)記）、標(biāo)記過程相對較慢，因為基因轉(zhuǎn)染后，蛋白的表達(dá)仍需時間。慢病毒GFP轉(zhuǎn)染有一定細(xì)胞毒作用，不適用于成熟的有分泌功能的LC，但適用于梭形SLCs，且回植后不影響它的分化及之后的激素分泌。可采用一定方法將成熟LC及梭形SLCs分開，將篩選出的類干細(xì)胞及前體細(xì)胞進(jìn)行綠色熒光標(biāo)記，對成熟的LC以量子點標(biāo)記，標(biāo)記成功后將其混合共培養(yǎng)，再回植，既不影響成熟LC生長、分泌，又能在體內(nèi)檢測相應(yīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸。或者篩選出類干細(xì)胞及前體細(xì)胞進(jìn)行綠色熒光標(biāo)記，標(biāo)記成功后誘導(dǎo)并促其向成熟細(xì)胞發(fā)育，然后回植于體內(nèi)培養(yǎng)，希望可以達(dá)到體內(nèi)長期存留標(biāo)記細(xì)胞的作用。甚至我們可以利用慢病毒GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞毒作用，使其天然的破壞成熟細(xì)胞而僅僅留下類干細(xì)胞及前體細(xì)胞并標(biāo)記，去進(jìn)行此類別更細(xì)化的細(xì)胞的相關(guān)研究。轉(zhuǎn)染圍繞慢病毒展開基因標(biāo)記，仍有許多問題有待研究，如慢病毒的毒性作用、轉(zhuǎn)歸，對宿主細(xì)胞的影響。等具體細(xì)節(jié)問題需要進(jìn)一步認(rèn)識后方能廣泛地應(yīng)用。

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[收稿日期]2010-11-26 [修回日期]2011-03-18

編輯/張惠娟