人骨髓間充質干細胞體外成骨分化過程中成骨相關基因的動態表達

[摘要]目的： 系統研究人骨髓間充質干細胞（ hBMSCs）體外成骨誘導分化過程中成骨相關基因的表達變化。方法：應用密度梯度離心法分離hBMSCs，取第2代細胞通過流式檢測及多向誘導分化方法進行干細胞鑒定；應用RT-PCR法對hBMSCs在體外成骨誘導不同時間點的成骨相關基因表達進行檢測。結果：第2代hBMSCs表達間充質干細胞表面標志CD44、CD90，具有成脂和成骨分化潛能。成骨相關基因在誘導早期部分表達，中期均有表達，基因表達大部分在14天達高峰，與礦化相關的基因表達在21天達高峰。結論：hBMSCs體外成骨誘導過程中成骨相關基因呈動態表達，其表達時序與成骨細胞生理發育基本相似。

[關鍵詞]人骨髓間充質干細胞；體外分化；成骨相關基因；表達模式

[中圖分類號]R318[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）04-0588-04

Kinetic expression pattern of osteogenic genes during in vitro osteogenesis of human bone mesenchymal stem cells

WU Huan-huan，GONG Fu-xing，WANG Qian，CAO Yi-lin，XIAO Ran

(Research Center of Plastic Surgery Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing 100144，China)

Abstracts:ObjectiveTo investigate the osteogenic related genes expression during in vitro osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells (hBMSCs).MethodshBMSCs were isolated by density gradient centrifugation. Surface markers and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The multiple differentiation potential of hBMSCs were identified using in vitro osteogenic and adipogenic induction. The osteogenic related genes expression of hBMSCs at different induction time point were evaluated by semiquantitative RT-PCR analysis.ResultsThe hBMSCs were derived from bone marrow and expressed CD44 and CD90， markers of mesenchymal stem cell. The second passage of hBMSCs showed adipogenic and osteogenic differentiation potential. During the osteogenic induction process，hBMSCs expressed part of osteogenic related genes in early stage， and all of them in middle stage.The peak expression of most of genes were on the 14th day， and the mineralization associated genes on the 21st day. ConclusionsThe osteogenic related gene expression of hBMSCs shows a dynamic progress during in vitro osteogenic induction， which is consistent with in vivo development of osteoblast.

Key words:hBMSCs;in vitro differentiation;osteogenic genes;expression pattern

骨缺損的修補和重建是修復重建外科臨床面臨的常見問題。臨床常用自體骨和人工材料修復骨缺損，但應用受到自體骨來源有限、供區損傷大、人工材料組織相容性差等缺點的制約，組織工程骨為臨床修復骨缺損提供了新的方案。骨髓間充質干細胞（BMSCs）具有可多向分化、體外擴增能力強、來源廣泛、取材方便、對機體損傷小等優點，已成為骨組織工程研究目前最常用的種子細胞[1-2]。

現已明確[3-5]可通過體外誘導（如BMP2，維生素D，地塞米松等）使BMSCs定向分化為成骨細胞。本實驗用RT-PCR法系統研究hBMSCs在體外成骨誘導分化過程中成骨相關基因表達，并參考正常成骨細胞分化周期[6-8]進行分析，希望為基于BMSCs的骨組織工程研究提供參考。

1材料和方法

1.1 hBMSCs的來源：成人骨髓血樣本5例，取自中國醫學科學院整形外科醫院5例先天齒槽嵴裂患者。5例經血、尿分析及系統檢查無代謝性骨病，無造血系統疾病，肝功能正常。術前經醫院倫理委員會及患者同意，手術中取髂骨移植時取骨髓血5ml，吸入預先加有0.5ml肝素的無菌針管中備用。

1.2 主要試劑及儀器：Ficoll分離液（GE公司，瑞士）；DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素（HYCLONE公司，美國）；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、茜素紅、油紅O（Sigma，美國）；NRaseA、Trizol、PI(Invitrogen，美國)；RT-PCR Kits (Invitrogen，美國)；流式抗體CD34-PE、CD44-PE、CD90-FIT C、CD45-FITC、PE和FITC同型對照（Bioscience公司，美國），培養皿（Corning，美國），倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）

1.3 hBMSCs的分離純化、擴增：采用密度梯度離心法[9]分離hBMSCs，將抽取的骨髓血置于Ficoll液上層，2 500r/min離心20min后，吸取中層的云霧狀有核細胞層，DMEM液洗滌，1 500r/min，離心5min，棄上清。將分離得到的單核細胞轉移至35mm的無菌培養皿中，加入足量完全培養基（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素）置于37℃，5% CO2孵箱中培養。培養48h后半量換液，以后每3天換液一次。原代克隆成熟后，用0.25%胰蛋白酶消化，待細胞變圓浮起時，用完全培養基終止消化，1 000r/min，離心5min，棄上清，加入5ml完全培養基，反復吹打制成單細胞懸液，接種于35mm無菌培養皿中，此為第1代細胞（P1），每3天換液一次。待P1代細胞長到80%～90%匯合時，用上述的方法消化傳代，再以5×103cells/cm2的接種密度接種到無菌培養皿中，此為第2代細胞（P2），每3天換液一次。用倒置顯微鏡觀察hBMSCs的形態變化及生長情況。

1.4 hBMSCs的鑒定

1.4.1 hBMSCs的細胞周期檢測：取2代hBMSCs經過0.25%胰酶消化離心(1 000r/5min)，細胞計數并重懸，然后調整細胞濃度至1×106/ml，用70%的酒精固定24h，用NRaseA處理30min，碘化丙啶(Pl)染色10min。流式細胞儀檢測并分析分析細胞周期。

1.4.2 hBMSCs的表面抗原表達檢測：取2代hBMSCs經過0.25%胰酶消化離心(1 000r/5min)，細胞計數并重懸，然后調整細胞濃度至1×106/ml，按Bioscience抗體說明書操作標記CD34-PE、CD44-PE、CD90-FITC、CD45-FITC，用Accuri C6流式細胞儀檢測表面標志物的表達，利用小鼠FITC IgG1-Is otype，PE IgG1 -Isotype 和空白作為對照。

1.4.3 hBMSCs的多向誘導分化：①成脂誘導：取2代hBMS Cs，以1×104cells/cm2接種到6孔板中，每孔加入2ml成脂誘導培養基[10-11]（0.5μM氫化可的松， 0.5μM IBMX，60μM 消炎痛，10μg/ml 胰島素）；誘導10天后，鈣-福爾馬林固定細胞，0.1mol/L的PBS輕洗3遍，60%異丙醇處理2min，加入油紅O染液搖床振洗30min，70%酒精調整顏色，鏡下觀察；②成骨誘導：取2代hBMSCs，以3×103cells/cm2接種到6孔板中，每孔加入2ml成骨誘導培養基[12]（10-8mmol/L地塞米松，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50mg/L維生素C）。每2～3天視情況換液。誘導21天后，4%多聚甲醛固定細胞，0.1mol/L的PBS輕洗3遍，浸于茜素紅染液中搖床振洗30～60min，三蒸水清洗數秒。

1.5 hBMSCs體外成骨誘導分化的成骨相關基因半定量RT-PCR檢測：取2代hBMSCs，以3×103cells/cm2接種到6孔板中，每孔加入2ml成骨誘導培養基，每2～3天換液。在體外成骨誘導的第3天，第7天，第14天，第21天采集樣本，以未誘導的hBMSCs作為陰性對照。

1.5.1 引物設計：利用GeneRuner 1.0軟件，根據Genebank提供的COL1A1、ALK、RUNX2、BMP2、COL XVA1、BSP、Osterix（OSX）、OCN、OPN、內參照18s mRNA基因序列設計10對引物（引物序列見表1）。

1.5.2 RNA提取：按照Trizol操作說明書提取樣本總RNA，最后加入適量0.1%DEPC·H20溶解RNA。紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，置于-80℃保存備用。

1.5.3 反轉錄及PCR反應：按照invitrogen試劑說明書反應體系條件進行實驗，產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

2結果

2.1 hBMSCs的分離培養：接種后48h，極少細胞貼壁，貼壁細胞呈梭形。4天后可見細胞呈成纖維細胞樣集落生長(CFU-F)。大約5～10天，細胞生長迅速并形成大克隆(圖1A)。

2.2 hBMSCs的鑒定

2.2.1 hBMSCs的細胞周期：流式細胞周期分析表明：G0/G1、S和G2/M的細胞所占的比例分別為88.4%、4.55%和7.06%，提示大部分細胞處于G0/G1期，僅僅少數細胞處于活躍的增殖期，與干細胞的細胞周期特性一致[13](圖1B)。

2.2.2 hBMSCs的表面抗原表達：流式細胞儀檢測結果顯示hBMSCs表達間充質干細胞標志物CD44、CD90（>95%），不表達造血干細胞標志物CD34、CD45（<5%），與相關文獻結果一致[14](圖1C、D)。

2.2.3 茜素紅染色顯示成骨分化鈣質沉積：hBMSCs在體外向成骨誘導21天，可見大量鈣質沉積，茜素紅染色陽性，對照組為陰性。(圖1E、F)

2.2.4 油紅O染色顯示成脂分化脂滴形成：hBMSCs在體外成脂誘導10天可出現明顯脂滴，油紅O染色陽性，對照組為陰性(圖1 G、H)。

2.3 hBMSCs體外成骨誘導分化的基因檢測：ALK 和COLⅠA1是成骨細胞中含量最豐富的兩種成分，在未誘導的hBMSCs中有少量的表達，成骨誘導后其表達水平增加，在誘導的第14天達到高峰。RUNX2和Osterix(OSX)是成骨分化過程重要的轉錄調控因子，RUNX2參與成骨分化的啟動，OSX調控骨的礦化，未誘導的hBMSCs不表達RUNX2，誘導后3天表達明顯增高，并在高水平保持相對穩定；未誘導的hBMSCs不表達轉錄因子OSX，成骨誘導后有微量的表達，在誘導14天達高峰。成骨細胞特異基質基因BSP、COLXVA1、BMP2表達水平隨著誘導時間增加而增加，BSP和COLXVA1表達在第14天達到高峰，BMP2表達在第21天達到高峰。與成骨細胞礦化相關的OCN、OPN在成骨誘導的第3天即出現表達，表達水平隨著培養的時間增加而增加，在第21天達到高峰(圖2)。

3討論

BMSCs在體外可被誘導向成骨細胞分化，是骨組織工程的重要種子細胞。正常生理情況下，成骨細胞在成熟過程中主要經歷3個階段：細胞增殖期，基質成熟期和礦化形成期。增殖期成骨細胞數量增加，以形成多層細胞，主要是堿性磷酸酶表達，并合成、分泌Ⅰ型膠原以便最終可以礦化形成骨結節；在細胞外基質成熟期，膠原繼續合成并相互交聯、成熟，表達成骨特異性的蛋白；在礦化形成期，細胞內的ALK活性下降，而與細胞外基質中羥磷灰石沉積相關的基因表達達到高峰，如骨橋蛋白、骨鈣素[6-8]。

本實驗采用常規誘導方案（地塞米松，β-甘油磷酸鈉，維生素C），觀察到誘導早期（第0～3天）的hBMSCs高表達COLⅠA1、ALK，低表達OPN、OCN，與處于增殖期的細胞類似。誘導中期（3～14天）的hBMSCs高表達BMP2、COL XVA1、BSP，與處于基質成熟期的細胞類似。誘導晚期（14～21天）的hBMSCs高表達OPN、OCN，且茜素紅染色顯示有豐富鈣質沉積，提示誘導的hBMSCs進入礦化形成期。對成骨相關轉錄因子的檢測發現：轉錄因子RUNX2在整個成骨誘導過程中持續高表達，對成骨分化的啟動和維持發揮著至關重要的作用；與成骨細胞礦化相關的轉錄因子OSX在成骨誘導14天達到高峰，與成骨礦化標志基因OCN、OPN表達高峰一致。

此外，我們還觀察到未誘導的骨髓基質干細胞也不同程度的表達ALK和COLⅠA1，雖然ALK和COLⅠA1是成骨細胞中含量最豐富的成分，但其與成骨能力沒有直接的相關性[15]。

綜上所述，本實驗通過對hBMSCs體外誘導成骨過程中成骨相關基因表達的動態分析，初步證實體外成骨誘導過程中，細胞分化也經歷細胞增殖期、基質成熟期和礦化形成期，成骨相關基因的表達呈現明顯的時序性，與生理情況下成骨細胞發育過程相似。但是，在組織工程骨研究中，hBMSCs體外成骨誘導后的最佳植入時期，還需要進一步的探索。

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[收稿日期]2010-11-15 [修回日期]2011-02-12

編輯/張惠娟