富含血小板血漿雙相接種法構建的組織工程骨修復山羊顱骨缺損

[摘要]目的：觀察以富含血小板血漿（platelet-rich plasma PRP）介導的雙相接種法構建的組織工程骨在體內的成骨是否優于普通雙相接種法和傳統靜滴接種法。方法：用傳統靜滴法（對照組）和富含血小板血漿（PRP組）、乏血小板血漿（PPP組）雙相接種法構建組織工程骨，并用其修復山羊顱骨臨界缺損，術后3月通過CT掃描、組織病理學觀察三組動物顱骨缺損處成骨情況。 結果：PRP組的成骨量顯著較PPP組合和對照組（P<0.05），PPP組合和對照組無顯著差異（P>0.05）。 結論：用PRP介導的雙相接種法構建組織工程骨在體內早期成骨優勢顯著；PRP雙相接種法是安全、簡便、實用、高效的細胞接種方法。

[關鍵詞]富含血小板血漿；細胞接種；骨組織工程；顱骨缺損

[中圖分類號]R318[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）04-0581-05

Repairing goat skull clinical defects with tissue engineering bones constructed by a biphasic seeding strategy with platelet-rich plasma

LEI Hua，TANG Xiao-Jun，PENG Zhe，NIU Feng，YU Bing，SHEN Shun-ying，GUI Lai

(The Sixth Department of Plastic Surgery Hospital，Peking Union Medical College，China Academy of Medical Sciences，Beijing 100144，China)

Abstract:ObjectiveTo confirm whether platelet-rich plasma (PRP) biphasic seeding strategy can significantly enhance the osteogenesis in vivo， compared with common biphasic seeding and traditional dropping seeding.MethodsTo construct tissue engineering bones with PRP biphasic seeding， common biphasic seeding and traditional dropping seeding respectively. To repair the goat skull clinical defects with the three groups of tissue engineering bones. At 3 days and 3 months postoperatively， goat skulls were examined by CT scanning， the pictures were analyzed by the Osirix software. Following CT scanning at 3 months postoperatively， animals were executed， the skull samples were harvested and examined histologically.ResultsThe new bone amount of the group of PRP biphasic seeding was significantly more than the groups of common biphasic seeding and traditional dropping seeding (P<0.05). The difference between the common biphasic seeding group and the traditional dropping seeding group was not obvious (P>0.05).ConclusionThe PRP biphasic seeding was safe， efficient and practical. The tissue engineering bone constructed by the PRP biphasic seeding strategy can improve the osteogenesis in vivo.

Key words：platelet-rich plasma;cell seeding;bone tissue engineering;skull defect

骨組織工程雖已被用于臨床，但是仍存在一些問題，如細胞與三維多孔支架材料如何能有效結合的問題。傳統的細胞接種方法，是將細胞懸液直接滴加在材料表面。這種方法簡便、適合于各種細胞和支架，但是如果三維多孔支架具有疏水性或親水性不強，不能像海綿一樣將細胞懸液吸入內部，大量細胞懸液流失。有時就算細胞懸液進入支架內部的孔洞里，由于沒有足夠的孔壁貼附，很多細胞液流失了[1-3]。所以有學者利用雙相接種法提高細胞和三維多孔支架的結合，也就是將細胞與纖維蛋白原或膠原液體混合，滴加或灌注于支架上，隨即滴加促凝劑，使纖維蛋白原或膠原凝固成膠凍狀，將細胞固定在支架表面或內部，提高了細胞的接種效率[4-14]。本研究也預用雙相接種法構建組織工程骨，但是用富含血小板血漿（platelet-rich plasma PRP）代替纖維蛋白原和膠原重懸細胞，原因是PRP不僅與纖維蛋白原和膠原一樣具有雙相性，在促凝劑的作用下從液態變為膠凍狀，而且含有大量血小板，血小板可被促凝劑激活釋放大量活性因子，其中包含多種生長因子，可以促進組織愈合等一系列生物事件[15-16]。所以我們推測PRP雙相接種法構建的組織工程骨可能進一步促進骨形成。為證實此假設，本研究分別用PRP，自體纖維蛋白原（platelet-poor plasma PPP），傳統靜滴法構建組織工程骨，修復山羊顱骨缺損，觀察體內骨形成情況。

1材料和方法

1.1 BMSCs原代培養及傳代：于一只中國青山羊（5月，10 kg）髂后上嵴抽取5ml骨髓（肝素抗凝）。15ml離心管中加入5ml人淋巴細胞分離液（Boster，武漢），將5ml骨髓沿管壁緩緩注入。200g離心，10min。取中層移至25cm2培養瓶中（Corning， Germany），加入高糖DMEM（Hyclone，USA）4ml，其中含有10% FBS（Hyclone，USA），100 U/ml 青霉素（Sigma，China），100mg/ml 鏈霉素（Sigma，China）。37℃，5% CO2，孵育4 天，換液。繼續孵育，3 天換一次液。待細胞90%融合時，0.25%胰酶（Sigma，China）消化、收集細胞至15ml離心管中，200g離心，10 min，棄上清液，DMEM重懸細胞團，以5 000/cm2的密度接種于75cm2培養瓶中，加入10ml培養基，37℃，5% CO2孵育，每3 天換液一次。一般第三代細胞用于實驗。

1.2PRP和PPP的制備：配置抗凝劑ACD：0.48g檸檬酸，1.32g檸檬酸鈉，1.47g葡萄糖（中國阿拉丁試劑有限公司）溶于100ml雙蒸水中，0.45μm過濾消毒，冷藏備用。于一只中國青山羊（5月，10kg）頸靜脈抽取全血40ml，其中加入40ml ACD，搖勻，移入50ml離心管，1 000g離心，15min。取上層血漿，棄紅細胞，二次離心，3 000g，20min。上層為清亮的PPP，移入另一15ml離心管中備用。中間層為白色的血小板，輕輕用吸管攪動吸出移至另一離心管中，下層紅細胞棄之。用少量PPP將血小板重懸，人工血小板計數，調節成濃度為106/μl的PRP備用[17-19]。

1.3 PLGA支架預處理：PLGA支架由濟南岱罡生物科技有限公司提供。PLA：PGA=75：25。孔徑大小100～300μm，空隙率80%。用11號尖刀片將大塊PLGA切成直徑11mm厚3 mm的圓盤狀。使用前，PLGA圓盤浸泡于75%酒精中24h，PBS漂洗3次，DMEM孵育30 min，取出置于無菌紗布上，吸干水分，再滴加細胞懸液，以增加PLGA的親水性。

1.4 細胞/支架復合體修復山羊顱骨缺損：中國青山羊8只，7～8月，17～20kg。隨機分成4組，2只/組。用牙科鉆在顱頂部制造2個直徑2cm全層顱骨缺損，去除局部骨膜，保護硬腦膜完整。4組動物分別用以下方法修復顱骨缺損：①對照組，不修復，直接分層縫合切口；②DMEM組，用DMEM重懸細胞（2×107/ml），每塊PLGA支架滴加500μl細胞懸液，植入顱骨缺損區，不固定，縫合切口；③PPP組，用PPP重懸細胞（2×107/ml），每塊PLGA支架滴加500μl細胞懸液，100μl 凝血酶促凝，植入顱骨缺損區；④PRP組，用PRP重懸細胞（2×107/ml），其余同PPP組。術后常規肌注抗生素，青霉素鈉 160萬U，2次/日，共3天。圖1示手術過程。

1.5 山羊顱骨缺損修復前后影像學檢查：術后3天及8周行山羊頭顱螺旋CT (Siemens Somatom 16， Germany) 掃描檢查，140 kV，130 mA，層厚1.5mm。用Osirix 軟件分析，計算新生骨的體積，并進行三維重建。

1.6 山羊顱骨缺損修復8周后組織學檢查：術后8周，頭顱螺旋CT檢查結束后，處死動物，用牙科鉆鉆取顱骨缺損區樣本，取材范圍包括顱骨缺損周邊2mm正常顱骨在內的所有區域。樣本放入4%的甲醛中固定48h，然后酒精逐級脫水，樹脂包埋，硬組織切片機（Leica SM2500，Heidelberg，Germany）切片，厚度40μm，HE染色，光學顯微鏡（Leica DM3000，Germany）觀察拍照。Osirix 軟件分析，計算各組代表性切片新生骨面積。

1.7 統計學分析：每個數值以平均值±標準差表示，組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey's test 。設P<0.05具有統計學顯著差異性。

2結果

2.1 BMSCs/PLGA復合體修復顱骨缺損影像學觀察：8只山羊平穩度過8周觀察期。CT平掃（圖2）和三維重建 (圖3) 顯示：8周時，PRP組，顱骨缺損部分愈合，缺損明顯縮小，新生骨不僅從缺損區邊緣向中心長入，在缺損的中心部位也有骨島形成。PPP組和DMEM組只有從缺損邊緣的長入的新生骨，而沒有中心部位硬腦膜表面的骨島形成?？瞻讓φ战M幾乎沒有新生骨形成。

各組平均新生骨體積見表1。PRP組的新生骨體積 (0.1660±0.03650)cm3顯著高于其他3組(P<0.05)。DMEM組(0.0915±0.02706)cm3和PPP組（0.0933±0.01010)cm3之間沒有顯著差異(P>0.05)。對照組 (0.0219±0.00917)cm3 的新生骨顯著低于其他3組 (P<0.05)。

2.2BMSCs/PLGA復合體修復顱骨缺損組織學檢查：8周處死動物解剖標本時，肉眼可見所有細胞/支架復合體植入處無炎癥反應，無纖維薄膜形成，PLGA材料幾乎全部吸收。硬組織切片顯示（圖4）：空白對照組沒有新骨形成，缺損區為疏松結締組織，缺損邊緣的膠原纖維較中心部致密。DMEM組、PPP組和PRP組的表現同影像學圖片。DMEM組和PPP組均有新生的骨島位于缺損區邊緣，中心部位均為纖維結締組織，PPP組的膠原纖維較DMEM組致密。PRP組缺損區邊緣的新生骨島較DMEM和PPP組大而多，中心區域也可見到新生骨島，其他部位為致密的纖維結締組織。

各組切片平均新生骨面積見表2?？瞻讓φ战M的新生骨面積（0.1782±0.08006）cm2明顯少于其他3組(P<0.05)。PRP組的新生骨面積(1.5449±0.2541)cm2顯著較其他組多 (P<0.05)。PPP組(1.0034±0.08087)cm2 新生骨面積較DMEM組(0.8731±0.02692)cm2多，但是差異不顯著 (P>0.05)。

3討論

實驗中8只山羊均平穩渡過整個觀察期，術后8周取標本時，可見山羊頭皮傷口愈合良好，無紅腫熱痛，頭皮下方組織無充血水腫，組織切片顯示無明顯炎癥細胞浸潤、血管增生等，支架材料均被吸收，顱骨缺損處已被新生骨和纖維組織覆蓋，這說明PRP和PLGA支架修復體內骨缺損是安全有效的。

CT冠狀位平掃和三維重建圖片以及組織學切片都顯示用PRP構建的組織工程骨修復山羊顱骨缺損，較PPP雙相接種法（普通雙相接種法）和傳統靜滴法構建的組織工程骨有更多的新骨形成。這可能是PRP中的血小板促進植入的BMSCs的增殖分化、趨化宿主基質細胞并促其增殖分化、促進細胞外基質分泌和血管再生，最終使相應的組織再生修復創傷[20]。盡管，這個復雜的生物過程還沒有被完全解析，但從我們的實驗結果可以肯定血小板在體內骨形成中有一定的促進作用，PRP也較PPP更適合做為雙相接種的媒介。

以往的研究表明，當PRP與BMSCs混合修復犬下頜骨缺損[17]和兔顱骨缺損時[21]，較單純PRP或自體骨顆粒更能促進體內新骨形成；當PRP與BMSCs和凍干異體骨顆?；旌闲迯屯霉晒沁h端髁狀突缺損時，表現出較好的促進骨愈合和骨塑性過程[22]；在上頜竇充填、竇底提升時，PRP與BMSCs的混合物較單純松質骨顆?；騿渭働RP更能促進骨再生[23]。這些研究結果均表明PRP在有BMSCs存在時可以促進骨再生。但是這些研究均是將PRP與細胞或自體骨顆粒直接混合植入受區發揮成骨作用，而本研究首次將PRP做為接種媒介將細胞與三維多孔支架結合，構建組織工程骨，修復骨缺損。這為骨缺損的三維個性化修復中，細胞與三維多孔支架的復合提供新思路。

根據以往文獻報道，雙相接種法的細胞接種效率顯著高于傳統靜滴法[8-11]，所以我們推測PPP組植入細胞初始量較多，成骨也應較多，但本研究結果顯示PPP雙相接種法與傳統接種法構建的組織工程骨在體內成骨數量沒有差異，這說明組織工程骨在體內的成骨不單純與植入細胞的初始量有關，與細胞植入后的增殖分化、宿主基質干細胞的趨化移入、骨缺損局部微環境，等等因素均密切相關，也正因如此，PRP中的血小板的生物作用顯得非常重要。不過PPP雙相接種法沒有顯示出較傳統靜滴法的優勢，也可能與實驗觀察時間短（8w）或樣本量小有關(n=4)。這些都有待于深入研究。

本研究的觀察時間較短(3月)，也許隨著時間延長，各組的成骨數量和質量會變得沒有差異，但本實驗至少可以說明PRP可在早期促進骨形成。

4結論

本研究結果顯示，由于PRP中大量血小板的存在，用PRP介導的雙相接種法構建組織工程骨在體內早期成骨顯著；而且PRP很容易地由自體全血經兩步離心獲得，無毒、無免疫源性，所以PRP雙相接種法是一個安全、實用、高效的細胞接種方法，可以有效輸送細胞至三維多孔支架內的同時，輸送自體生物因子，其中包括很多種生長因子。

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[收稿日期]2010-12-28 [修回日期]2011-03-20

編輯/張惠娟