牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒斑點酶聯免疫吸附檢測法的建立

摘要：采用辛酸－硫酸銨法提取兔抗ＢＶＤＶ高免血清中的免疫球蛋白ＩｇＧ，在混合硝酸纖維素膜上進行間接酶聯免疫吸附試驗，建立了檢測ＢＶＤＶ抗原的斑點酶聯免疫吸附檢測法。結果顯示，抗體最佳包被量為４００μｇ／ｍＬ，酶標記羊抗兔ＩｇＧ的最佳工作濃度是１∶５００倍稀釋，抗原最小檢出量是５．３６μｇ／ｍＬ。應用建立的檢測方法對７８份腹瀉奶牛血樣進行了檢測，陽性檢出率為５８．９７％；經卡方（χ2）檢驗分析，建立的間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ與ＡＧＰ法相比較，陽性檢出率差異顯著。證實該方法敏感性高、簡便快速，適合于基層獸醫的檢測診斷。

關鍵詞：牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒；斑點酶聯免疫吸附法；檢測

中圖分類號：Ｓ８５２．５＋３文獻標識碼：B文章編號：１００７－２７３Ｘ（２０11）05-0009-03

牛病毒性腹瀉病毒病是由黃病毒科、瘟病毒屬的牛病毒性腹瀉－黏膜病毒（Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉａｒｒｈｅａ－Ｍｕｃｏｓａｌ Ｄｉｓｅｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ，ＢＶＤ－ＭＤＶ）引起的，臨床上以發熱、黏膜糜爛潰瘍、白細胞減少、腹瀉、懷孕母牛流產或產畸型胎兒為主要特征［１］。１９４６年美國人Ｏｌａｆｓｏｎ首次發現并報道此病［２］，目前已呈世界性分布。

目前診斷該病的方法有病毒分離、瓊脂擴散試驗、中和試驗、酶聯免疫吸附試驗等［３］，但這些方法存在檢出率低、檢測時間長等缺點，尤其是對于免疫耐受和持續性感染的牛出現漏檢。本研究旨在建立一種簡便有效的檢測牛病毒性腹瀉病毒抗原的斑點酶聯免疫吸附法。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１抗ＢＶＤＶ高免血清的制備以ＢＶＤＶ－Ｏｒｅｇｏｎ Ｃ２４Ｖ標準毒株的ＭＤＢＫ細胞培養物作為免疫原按常規方法免疫健康家兔［４，５］，待效價達１∶１２８時，心臟采血，收集血清，－２０℃保存備用。

１．１．２兔抗ＢＶＤＶ ＩｇＧ的提取［６］將兔抗ＢＶＤＶ高免血清以辛酸－硫酸銨法提純免疫球蛋白ＩｇＧ。

１．１．３樣品及處理待測樣品為河北省不同地區采集的腹瀉牛血樣，－２０℃保存。ＢＶＤＶ陽性血樣和ＢＶＤＶ陽性糞樣為自然感染腹瀉奶牛血樣與糞樣，經電鏡檢查含有大量ＢＶＤＶ粒子。

１．２間接斑點酶聯免疫吸附法檢測ＢＶＤＶ抗原方法的建立

１．２．１間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ的操作程序操作流程：壓跡—點樣—洗滌—封閉—加抗體—加酶標羊抗兔—顯色—終止反應—判定結果。結果判定標準：以在膜圓圈內出現明顯棕紅色斑點判定為陽性，無色為陰性。

１．２．２間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ試驗條件的選擇

（１）抗體最佳工作濃度的篩選：用抗體稀釋液將純化ＩｇＧ稀釋成５０、 １００、 ２００、 ３００、 ４００、 ５００、６００μｇ／ｍＬ，包被膜片，浸洗３次，封閉。將陽性抗原（ＢＶＤＶ病毒濃縮液）以抗原稀釋液作１∶１０倍稀釋，酶標羊抗兔作１∶５００、１∶１ ０００倍稀釋，依次加入各孔，１００μＬ／孔，置３７℃溫箱１ｈ，洗滌。以出現斑點顏色最深、背景顏色最淺的ＩｇＧ的量和酶標羊抗兔的稀釋度作為本試驗的工作濃度。

（２）抗原最低檢出量的確定：用抗體稀釋液以工作濃度稀釋抗體，將陽性抗原以抗原稀釋液作１∶２０、１∶４０、１∶８０、１∶１６０、１∶３２０、１∶６４０、１∶１ ２８０、１∶２ ５６０、

１∶５ １２０倍稀釋，然后加入最適濃度的酶標羊抗兔，以出現斑點顏色最深，背景顏色最淺時陽性抗原最大稀釋倍數所對應的抗原濃度即為抗原最低檢出量。

１．２．３間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ的特異性試驗

（１）特異性阻斷試驗：將ＢＶＤＶ濃縮液分別與標準陰性血清、正常兔血清、兔抗ＢＶＤＶ陽性血清、兔抗ＢＶＤＶ ＩｇＧ和正常ＭＤＢＫ細胞液混合，置３７℃溫箱１ｈ，然后進行間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ試驗，根據結果出現斑點的情況確定試驗的特異性。

（２）交叉性試驗：用建立的間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法對ＢＶＤＶ細胞培養液、ＢＶＤＶ陽性血樣、ＢＶＤＶ陽性糞樣、輪狀病毒、豬瘟兔化弱毒疫苗、健康牛血樣、正常ＭＤＢＫ細胞液進行檢測，觀察結果。

（３）重復性試驗：將ＢＶＤＶ細胞培養液、ＢＶＤＶ陽性血樣、正常ＭＤＢＫ細胞液、健康牛血樣、ＢＶＤＶ陽性糞樣按已建立的間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法重復檢測３次，觀察結果。

１．２．４Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法的初步應用用建立的Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法和ＡＧＰ法分別對河北省不同地區采集的７８份腹瀉奶牛血樣進行檢測。

２結果與分析

２．１抗體最佳工作濃度的篩選

經方陣法測定，兔抗ＢＶＤＶ ＩｇＧ的最佳工作濃度為４００μｇ／ｍＬ，酶標羊抗兔的最佳稀釋濃度是１∶５００倍稀釋（表１）。

２．２抗原最低檢出量的確定

結果見表２，由表２可見，間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法最低可檢出１ ２８０倍稀釋的病毒濃縮液，即５．３６μｇ／ｍＬ。

２．３間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ的特異性試驗

２．３．１阻斷試驗試驗結果表明，兔抗ＢＶＤＶ陽性血清和兔抗ＢＶＤＶ ＩｇＧ可阻斷ＢＶＤＶ與酶標抗體之間的陽性反應，而標準陰性血清、正常兔血清和正常ＭＤＢＫ細胞液不能阻斷ＢＶＤＶ與酶標抗體之間的陽性反應（表３）。

２．３．２交叉性試驗結果見表４。由表４可見，經間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ檢測，ＢＶＤＶ細胞培養液、ＢＶＤＶ陽性血樣、ＢＶＤＶ陽性糞樣反應陽性，而與豬瘟兔化弱毒疫苗、正常ＭＤＢＫ細胞液、健康牛血樣、輪狀病毒無交叉反應。

２．３．３重復性試驗從表５可以看出，３次重復試驗結果差異不明顯，說明這種方法重復性很好。

２．４Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法的初步應用

從河北省不同地區采集腹瀉奶牛血樣７８份，用ＡＧＰ法和建立的Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法進行檢測，結果見表6。Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和ＡＧＰ的ＢＶＤＶ陽性檢出率分別為５５．１３％和３４．６２％。經卡方（χ２）檢驗分析，這兩種方法比較，χ２＝６．６３４，差異顯著（Ｐ＜０．０５）。

３討論

目前臨床上檢測ＢＶＤＶ的常用的病毒分離法和中和試驗需要細胞培養，費時費力，不適合大規模的病毒檢測和流行病學調查；瓊擴試驗準確性不高，檢出率較低；ＥＬＩＳＡ法需要酶標檢測儀等貴重儀器，不利于基層使用。而Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法操作簡便，費用低，只需要２～３h即可得出結果且結果判斷直觀，而且能從樣品中檢出持續性感染的動物，適用于基層單位對ＢＶＤＶ的檢測和流行病學調查。本試驗應用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法和ＡＧＰ法對７８例臨床病例進行檢測，結果顯示，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法與ＡＧＰ相比較，陽性率差異顯著，該方法的陽性檢出率明顯高于ＡＧＰ，表明Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法具有高度敏感性，非常適用于臨床診斷和檢疫。

參考文獻：

［１］王新平，劉紅，宣華，等．綿羊感染牛病毒性腹瀉－粘膜病病毒的調查研究［Ｊ］．獸醫大學學報，１９９３，１３（３）：２1９－２２1．

［２］ＯＬＡＦＳＯＮ Ｐ，ＭACＣＡＬＬＵＭ Ａ Ｄ，ＦＯＸ Ｆ Ｈ． Ａｎ ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ ｎｅｗ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］． Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｖｅｔ，１９４６，３６：２０５－２１３．

［３］殷震，劉景華．動物病毒學（第二版）［Ｍ］．北京：科學出版社，１９９７．

［４］高存福．牛病毒性腹瀉病毒雙抗體夾心ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ診斷方法的建立及Ｅ２基因變異分析［Ｄ］． 保定：河北農業大學，２００５，６．

［５］王世若，王興龍，韓文瑜，等．現代動物免疫學（第二版）［Ｍ］．長春：吉林科學技術出版社，２００１．

［６］白麗，王晶．應用辛酸硫酸銨法提取小鼠腹水和血清中的ＩｇＧ抗體［Ｊ］．大理醫學院學報，２０００，９（４）：３－５．