豬丹毒絲菌PCR檢測方法的建立

摘要：根據Ｇｅｎbａｎｋ中豬丹毒絲菌的１６Ｓ ｒRＮＡ基因序列的差異設計特異性引物，對６株臨床分離的丹毒絲菌菌株進行ＰＣＲ擴增。結果顯示，此引物對６株丹毒絲菌均擴增出與預期大小４７2 ｂｐ相一致的片段，而對多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌等１０種病原體的擴增結果均為陰性；ＰＣＲ敏感性試驗結果表明，該方法可以檢測到１８６ ＣＦＵ／μＬ的丹毒絲菌，并可以利用臨床病料直接進行檢測，節省了檢測時間和勞動力，能夠適用于日常實驗室的檢測。

關鍵字：丹毒絲菌；１６Ｓ ｒＤＮＡ；ＰＣＲ

中圖分類號：Ｓ８５２．６１文獻標識碼：B文章編號：１００７－２７３Ｘ（２０11）05-0007-02

丹毒絲菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）是專性厭氧的革蘭氏陽性小桿菌［１］。該屬主要包括兩個種，紅斑丹毒絲菌（Ｅ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）和扁桃體丹毒絲菌（Ｅ．ｔｏｎｓｉｌｌａｒｕｍ），其中僅紅斑丹毒絲菌（俗稱豬丹毒絲菌）是具有致病力的毒力種，是豬丹毒和人類類丹毒癥的致病菌，豬感染后致死率極高，使養豬業遭受巨大經濟損失，同時也對人類的健康構成一定的威脅［２］。丹毒絲菌的血清型很多，現在已經報道有１６種血清型，不同的血清型在毒性上的差別很大，一般從病豬分離的菌株絕大多數是血清型１ａ、１ｂ和２型［３］，能夠引起豬的急性或亞急性敗血癥和慢性的關節炎及心內膜炎，對其他許多畜禽也存在一定的危害［４］。由于丹毒絲菌的營養要求高，細菌菌落較小，分離鑒定繁瑣費時，給臨床上丹毒絲菌的快速診斷帶來了許多困難。為此，湖南農業大學動物醫學院病原分子生物學和免疫學實驗室根據Ｇｅｎｅｂａｎｋ上的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列設計通用引物，建立快速檢測丹毒絲菌的ＰＣＲ鑒定方法。

１材料與方法

１．１試驗菌株

丹毒絲菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、氣單胞菌、李氏桿菌、芽孢桿菌和鏈球菌，由湖南農業大學動物醫學院病原分子生物學和免疫學實驗室分離、鑒定和保存；糞腸球菌（ＡＣＴＴ ２９２１２）、大腸桿菌（ＡＣＴＴ ３５２１８）、金黃色葡萄球菌（ＡＣＴＴ ２９２１３）購于杭州天和微生物公司；６株丹毒絲菌臨床分離株，分離于湖南各地送檢至湖南農業大學傳染病實驗室的豬病料。

１．２主要儀器與試劑

Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶購自天根生物工程公司；ｄＮＴＰ（２．５ｍmol/L）、ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ均購自大連寶生物工程公司；ＴＳＢ培養基購于北京鼎國昌盛生物技術公司。

１．３引物的設計

從ＮＣＢＩ庫查出已發表的丹毒絲菌所有１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列中，找出１６Ｓ ｒＲＮＡ基因的保守區；運用ＤＮＡｓｔａｒ中的ＭｅｇＡｌｉｇｎ子程序分別與其他常見細菌（大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌、鏈球菌）的基因序列進行多重比較，找出丹毒絲菌的特異序列。以ＡＢ０３４２００序列，利用軟件Oｌｉｇｏ ６在丹毒絲菌１６Ｓ ｒＲＮＡ基因的特異保守區內設計ＰＣＲ引物，Ｆ：５’－ＴＧＡＣＡＴＡＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＧＣＡ－３’（位置９８２－１００１），Ｒ：５’－ＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＡＧＴＡＡＡＣＴＡ－３’（位置１４３４－１４５３），預計擴增產物４７2ｂｐ。

１．４ＰＣＲ模板的準備

挑取一個菌落置于裝有２００μＬ去離子水的離心管中，攪勻。將離心管置于１００℃水浴加熱５ｍｉｎ，冰浴冷卻，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ離心２ｍｉｎ，吸取上清至另一離心管，置－２０°Ｃ凍存備用。同時也用純培養菌落和液體培養菌液直接作為ＰＣＲ模板。

１．５ＰＣＲ反應條件選擇

１０×Bｕｆｆｅｒ ２μＬ，ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，上、下游引物各０．２μＬ（引物量１０μｍｏｌ／Ｌ），Ｔａｑ酶（２．５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，模板１μＬ，加超純水至２５μＬ總體系。９５℃預變性５ｍｉｎ；９４℃變性３０ｓ，計算選擇首個退火溫度５５℃、３０ｓ，然后分別加減１℃共設置10個梯度（50~60℃），７２℃延伸３０ｓ，３０個循環；７２℃終延伸７ｍｉｎ，篩選最佳退火溫度。ＰＣＲ產物置于１０ｇ／Ｌ瓊脂糖凝膠中電泳，經溴化乙錠染色后在凝膠成像系統拍照分析。

１．６ＰＣＲ特異性

將本實驗室保存菌種多殺性巴氏桿菌、氣單胞菌、李氏桿菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、鏈球菌、糞腸球菌（ＡＣＴＴ ２９２１２）、大腸桿菌（ＡＣＴＴ ３５２１８）、金黃色葡萄球菌（ＡＣＴＴ ２９２１３）與丹毒絲菌用１．３設計的引物按照上述ＰＣＲ反應條件對菌株進行擴增，另外將丹毒絲菌的ＰＣＲ產物送往上海生物工程有限公司測序，通過核苷酸序列分析確定ＰＣＲ擴增的片段為目的片段。

１．７ＰＣＲ敏感性試驗

挑取丹毒絲菌固體培養物菌落１個或數個溶于５０μＬ生理鹽水中，吸取１０μＬ，加入９０μＬ生理鹽水，然后依次倍比稀釋，做成１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５、１０－６、１０－７、１０－８ 8個梯度，將每個梯度吸取１μＬ作為模板進行ＰＣＲ擴增，另吸取５０μＬ稀釋液分別涂布于8個５％血清營養瓊脂培養基，每個梯度3次重復，３７℃恒溫培養３６ｈ，計算菌落形成單位（ＣＦＵ，Ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ），換算出原ＰＣＲ模板中的菌落形成單位，評價敏感性。

１．８ＰＣＲ檢測人工感染病料

用丹毒絲菌皮下接種小白鼠，致死后解剖取實質器官肝、肺、腦為病料，用酚－氯仿抽提法從病料中提取ＤＮＡ作為模板直接進行ＰＣＲ擴增。

２結果

２．１ＰＣＲ檢測方法的特異性

用設計的特異性引物對丹毒絲菌和多殺性巴氏桿菌、氣單胞菌、李氏桿菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、鏈球菌、糞腸球菌（ＡＣＴＴ ２９２１２）、大腸桿菌（ＡＣＴＴ ３５２１８）、金黃色葡萄球菌（ＡＣＴＴ ２９２１３）和空白對照進行ＰＣＲ擴增，結果只有丹毒絲菌菌株擴增出１條４７2ｂｐ的目的條帶，其他菌株和空白對照均無相應條帶擴出（見圖１）。將所得到的丹毒絲菌１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列與Ｇｅｎbａｎｋ中已知的丹毒絲菌１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列進行比對，同源性達９８%～100％。

２．２ＰＣＲ檢測方法的敏感性

以１個丹毒絲菌菌落為模板做１０－１～１０－９稀釋，ＰＣＲ擴增呈現陽性結果（見圖２），菌落形成單位計數顯示１０－５稀釋的細菌為１８６CFU／μＬ。故該ＰＣＲ方法最低可檢出１８６CFU／μＬ。

２．3ＰＣＲ檢測方法的應用

２．3．１ＰＣＲ用于臨床分離株的鑒定利用該ＰＣＲ檢測方法對傳統培養方法分離出的６株丹毒絲菌進行檢測，結果均能擴增出１條４７2ｂｐ特異性ＤＮＡ條帶（圖３）。

２．3．２ＰＣＲ用于人工感染病料的檢測由圖４可見，人工感染丹毒絲菌的小鼠的肺、腦和肝組織均可用ＰＣＲ方法直接檢測到，未經感染的小鼠則為陰性。

３討論

丹毒絲菌在自然界分布十分廣泛，對環境有很強的抵抗力，可寄生于哺乳類、鳥類、兩棲類、爬行類及魚類［５］，其對豬感染最為普遍，給養豬業造成了巨大的經濟損失。雖然采用細菌分離培養、染色鏡檢、生化鑒定以及生長凝集試驗（ＥＳＣＡ）等傳統細菌分離鑒定方法和用１６Ｓ ｒＲＮＡ基因的保守序列設計的特異引物建立的ＰＣＲ擴增方法都可以鑒定丹毒絲菌。但丹毒絲菌分離培養要求比較苛刻、細菌生長時間長，用傳統方法比較耗時費力，鑒定時間長，易受細菌生理條件和抗生素使用限制，很難滿足臨床要求。目前，ＰＣＲ技術由于敏感性強，特異性好，檢測時間短等特點被廣泛應用于許多病原菌的快速鑒定。本試驗建立的丹毒絲菌ＰＣＲ檢測方法，對于細菌培養物不需對模板做特殊處理，可直接使用細菌的液體培養液或挑取單個菌落部分細菌作為模板都可以擴增出目的片段，克服了丹毒絲菌傳統培養法在臨床應用上的不足。該ＰＣＲ方法最低可檢測到１８６CFU／μＬ，其敏感性較高。在對培養的細菌作為模板時不需要特殊處理，使用方便，也可通過提取病料中ＤＮＡ作模板，直接對病料進行檢測，不需經細菌培養，這樣可以縮小日常檢測的時間。

參考文獻：

［１］ＷOOD Ｒ Ｌ． Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｓｗｉｎｅ［Ｍ］．８ｔｈ．Ａｍｅｓ：Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９．４１９-４３０．

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［４］王雪敏，王斌．火雞丹毒研究進展［Ｊ］． 動物科學與動物醫學， ２００３（１０）：２７．

［５］ＭＡＫＩＮＯ S I，ＹＡＭＡＭＯＴＯ Ｋ，ＡＳＡＫＵＲＡ Ｈ，ｅｔ ａｌ． Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ＳｐａＡ，ｏｆ Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ ｂｉｎｄｓ ｔｏ Ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅｓ［Ｊ］． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０００，１８６（2），３１３－３１７．