AKTA explorer 100蛋白質(zhì)快速純化工藝開拓系統(tǒng)使用體會

摘 要:AKTA Explorer 100蛋白質(zhì)快速純化工藝開拓系統(tǒng)是美國通用電器公司生產(chǎn)的分離純化蛋白質(zhì)以及核酸等生物大分子的裝置。我室使用該系統(tǒng)先后分離純化了福安泰-03和重組福安泰-03，在使用過程中碰到了一些問題并積累了一些經(jīng)驗。

關(guān)鍵詞:使用 快速純化開拓系統(tǒng) 體會

中圖分類號:R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1674-098X(2011)02(c)-0248-01

AKTA Explorer 100蛋白質(zhì)快速純化工藝開拓系統(tǒng)是美國通用電器(GE)公司(原瑞典安瑪西亞公司)生產(chǎn)的分離純化蛋白質(zhì)以及核酸等生物大分子的裝置。可以選用離子交換(Ion Exchange，IEX)、凝膠過濾(chromatography Fechange，GF)、疏水相互作用(Hydrophobic Interaction Chromatography media，HIC)、親和層析(Affinity Chromatography，AC)和反向?qū)游?Reversed Phase Chromatography， RPC)等不同分離原理的柱填料來實現(xiàn)生物大分子的分離純化。該系統(tǒng)內(nèi)使用隋性氣體管道，環(huán)境溫和，減少對蛋白質(zhì)活性的影響。能用于純化工藝的全新開發(fā)和優(yōu)化工作，該系統(tǒng)能設(shè)定方法自動運行，分析純化通量大，有三個光吸收檢測點，分離樣品能自動分部收集(流速范圍:0.01～100ml/min;UV-900紫外光/可見光檢測器，波長范圍:190～700nm;pH/C-900pH/電導(dǎo)檢測器，pH范圍:2-12;電導(dǎo)范圍:1μS/cm～999.9mS/cm;Frac-900組分收集器)。

AKTA explorer 100快速純化工藝開拓系統(tǒng)特點:能夠快速大量純化重組蛋白，并可以進(jìn)行重組藥物蛋白的中試生產(chǎn)，具有自動緩沖液制備;系統(tǒng)配有專家輔助軟件，提供系統(tǒng)操作、分離方法、凝膠資料等協(xié)助及多個專業(yè)純化方案建議。無論做肽圖分析，或是做各種重組蛋白的制備生產(chǎn)，都能滿足。我室使用該系統(tǒng)先后分離純化了福安泰-03[1-3]和重組福安泰-03[4]，過程中碰到了一些問題并積累了一些經(jīng)驗。

1 低流速基線上升類似長城垛口不斷出現(xiàn)，加大流速基線回復(fù)穩(wěn)定

(1)紫外流通池有小氣泡集聚，流通池后連接flow restrictor。用1mol/L NaOH，95%乙醇，1mol/L醋酸沖洗;

(2)緩沖液沒有脫氣，緩沖液脫氣，緩沖液超聲脫氣10min;每天關(guān)機(jī)前，自動清洗1次。

2 裂開的色譜峰

(1)柱頭膠與柱頭之間有空隙。壓緊柱頭。

(2)若反相層析出現(xiàn)，可樣品緩沖液與A液不同，將樣品用A液溶解。

3 在于凝膠過濾層析多次進(jìn)樣

下游純化最后一步往往用凝膠過濾分子篩去除一些雜蛋白和鹽。由于上樣量只有1%～5%柱體積，限制了產(chǎn)量，其實真正目標(biāo)蛋白與雜蛋白在1/3柱體積后才被洗脫，首1/3柱體積的洗脫液將洗脫凝膠介質(zhì)分子量范圍以上的大蛋白，而最后1/3柱體積則洗脫鹽等小分子。解決方法:上樣5%柱體積樣品后洗脫1/3柱體積可以上第二次5%柱體積樣品，洗脫3/2柱體積后，上第三次5%樣品，可大大縮短純化時間及增加處理量。

4 pH曲線對pH變化無響應(yīng)[5]

(1)電極玻璃膜可能破碎。如破碎，更換電極。

(2)pH響應(yīng)緩慢或不能校準(zhǔn)。檢查電極玻璃膜。如玻璃膜變干，將電極浸在電極緩沖液中過夜，電極可恢復(fù);如玻璃膜受污染，按照Monitor pH/C-900用戶手冊4.3節(jié)清洗電極。

(3)不正確/不穩(wěn)定的pH讀數(shù)。如懷疑流動池有空氣，小心輕敲流動池或?qū)⒘鲃映貎A斜將空氣排除。或用緩沖液以20mL/min的速度沖洗流動池30s。在pH電極后使用節(jié)流閥FR-902。檢查pH電極的校準(zhǔn)。

5 泵P-900的問題[6]

(1)在泵頭和側(cè)板之間液體泄漏。活塞密封或沖洗膜裝配不正確或磨損。如老化，更換活塞密封。

(2)低洗脫液流速和噪聲。①按照Pump P-900用戶手冊4.4節(jié)拆卸泵頭并當(dāng)活塞移動時檢查活塞彈簧。必要則更換之。②如彈簧腐蝕，檢查活塞密封和沖洗膜。確保在用高鹽濃度含水緩沖液工作時活塞沖洗系統(tǒng)總在使用。③檢查活塞是否損壞，如果損壞按照Pump P-900用戶手冊4.5節(jié)更換活塞。④記住用新的零件更換活塞密封和沖洗膜。

(3)連接器周圍泄漏和/或周圍有結(jié)晶物。擰下連接器，并檢查是否損壞或裝配不正確。如果損壞則更換連接器;用手指輕輕擰緊連接器。

(4)反常的泵壓。檢查泵功能，進(jìn)行壓力記錄，或通過在UNICORN檢查壓力。通過觀察在Check菜單的活塞沖程指示器和壓力跡線，可以找到功能反常的泵頭。壓力記錄不正常的原因，如泵頭捕集有空氣;連接處泄漏;活塞密封泄漏;檢查閥功能不正常。

(5)儀器使用一個月后，要更換在線濾膜，減少柱前壓力;

(6)每天使用完儀器后，做一次系統(tǒng)清洗;使用一段時間后，用1mol/L NaOH對系統(tǒng)進(jìn)行消毒。

6 閥IV-908，PV-908，INV-907出現(xiàn)故障

(1)閥不能轉(zhuǎn)換。檢查對泵的連接。此閥應(yīng)連接UniNet 2插座，不是UniNet1插座。檢查閥上的ID-轉(zhuǎn)換，ID數(shù)字應(yīng)與UNICORN設(shè)置的數(shù)字相當(dāng)。檢查連接電纜，如需則更換之。

(2)此閥轉(zhuǎn)換到錯誤位置。此閥零件在更換后裝配的不正確。檢查分配板標(biāo)志i/o或3是否水平的。如是外部泄漏，檢查管件連接，如需則更換之;如是閥內(nèi)部泄漏，在閥體下邊的小孔能夠檢測內(nèi)部泄漏。按照有關(guān)閥的說明的4節(jié)更換通道板和分配板和就地清洗。

7 UV-900

晚上平衡柱子超過4h時，應(yīng)在程序上關(guān)閉紫外燈，紫外燈的平均壽命是4000h左右。

8.樣品泵P950泵，流速50ml/min時，泵壓可達(dá)10巴。上樣泵使用一段時間后，要在系統(tǒng)中調(diào)整歸零，防止在上樣后壓力過大導(dǎo)致停機(jī)。

參考文獻(xiàn)

[1]蘇偉明，馬潤娣，等.一種新的源自赤魟的強血管生成抑制劑福安泰203的分離和鑒定[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報.2009，25(9):849～854.

[2]蘇偉明，于立堅，等.從赤魟組織中分離到的福安肽的抗腫瘤活性的初步研究[J].中國生化藥物雜志，2008，29(1):9～11.

[3]蘇偉明，馬潤娣，等.離子交換層析純化重組福安泰-03功能域的工藝條件研究[J].長江大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)理工卷， 2010，7(2):25～27.

[4]黃來珍，馬潤娣，等.重組福安泰-03抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2009，26(3):561～567.

[5]AKTA design Monitor pH/C-900 User manual(18-1120-06).Amersham Pharmacia biotech.

[6]AKTA design Monitor Pupm P-900 User manual (18-1120-04).Amersham Pharmacia biotech.