LAMP技術(shù)在檢測原料乳及乳制品致病菌方面的應(yīng)用

胡惠秩，滿朝新，蔣亞男，楊士芹，謝鯤昊，姜毓君

（1.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

LAMP技術(shù)在檢測原料乳及乳制品致病菌方面的應(yīng)用

胡惠秩1，2，滿朝新1，蔣亞男2，楊士芹2，謝鯤昊2，姜毓君1，2

（1.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

環(huán)介導等溫擴增（LAMP，Loop-Mediated Isothermal Amplification）作為一種新的檢測技術(shù)，具有操作簡便、快速、特異性強等優(yōu)點，目前已在原料乳及乳制品致病菌的檢測中得到初步應(yīng)用，本文綜述了這一技術(shù)的原理、鑒別及檢測的方法，及其在原料乳及乳制品檢測方面的應(yīng)用進展。

LAMP；原料乳及乳制品；檢測

0 引言

原料乳及其制品在生產(chǎn)、加工及儲運過程中非常容易受到致病菌的污染，乳品中各種致病菌檢測成為對其質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。目前對于致病菌檢測的方法中，微生物培養(yǎng)法檢測時間長，靈敏度相對不高；而傳統(tǒng)的核酸擴增技術(shù)，如PCR、核酸序列擴增法和自序列復(fù)制及鏈置換擴增法等，雖然可以在一定時間內(nèi)擴增模板DNA達到一定的數(shù)量級，但在實際操作中仍然存在很多缺點[2]。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是日本學者Notomi等[3]在2000年研發(fā)的一種新型核酸擴增技術(shù)，目前已在食品安全檢測、臨床醫(yī)學和生物學等領(lǐng)域中應(yīng)用。

1 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）

1.1 LAMP的原理

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）是2000年由日本榮研株式會社開發(fā)的一種簡單、快速、特異、經(jīng)濟的新型核酸擴增技術(shù)，該方法的特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4個特異的引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下反應(yīng)幾十分鐘即可完成。具有高特異性和等溫擴增的特點，1 h之內(nèi)可將靶基因擴增109～1010倍。在DNA延伸合成時，從脫氧核苷三磷酸基質(zhì)（dNTPs）中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子結(jié)合，會產(chǎn)生一種焦磷酸鎂衍生物的白色沉淀，利用這一特點用肉眼即可判斷擴增與否。

1.2 LAMP的反應(yīng)過程

LAMP反應(yīng)的操作很簡單，只需將要反應(yīng)的混合物先在60～65℃孵育60 min左右，在80℃孵育10 min終止酶活，即可完成反應(yīng)。

1.3 LAMP結(jié)果的判定

根據(jù)LAMP反應(yīng)的特點，可以采取4種檢測方法對擴增產(chǎn)物進行檢驗。

1.3.1肉眼觀察法

根據(jù)副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的產(chǎn)生來判斷擴增反應(yīng)是否發(fā)生。

1.3.2 添加熒光染料法

向反應(yīng)體系添加溴化乙錠（EB）、SYBR GreenⅠ等熒光染料進行染色，從而檢測擴增反應(yīng)是否發(fā)生。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳法

通過LAMP反應(yīng)原理可知，LAMP法的核酸擴增產(chǎn)物是莖環(huán)DNA組成的混合物，它在瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)的不是一條單鏈而是梯狀條帶，這是LAMP反應(yīng)所特有的。我們可以根據(jù)是否形成這種典型的梯形條帶來判斷反應(yīng)是否發(fā)生。

1.3.4 LAMP實時監(jiān)控濁度儀

由日本榮研株式會研制出專門用于LAMP檢測的實時監(jiān)控終點濁度儀，可以實現(xiàn)對LAMP擴增過程的全程實時監(jiān)控。

2 LAMP技術(shù)在檢測原料乳及乳制品中致病菌的應(yīng)用

2.1 檢測乳中金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）廣泛分布于自然界中，是食物中毒的主要致病菌之一，也是引起奶牛患病的重要因素，其中葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal Enterotoxin,SE）是致病因子。SE對高溫的耐受力強，100℃煮沸30 min不受破壞[4]。目前從金黃色葡萄球菌中檢出SE達16種之多，但主要致病型為SEA和SED型。2007年M.Goto[5]等人，在30株金黃色葡萄球菌中針對4種產(chǎn)腸毒素的基因SEA、SEB、SEC和SED進行LAMP方法的檢測，發(fā)現(xiàn)LAMP方法可以在60 min內(nèi)檢出，其靈敏度明顯高于PCR方法。2010年，王德國等人[6]應(yīng)用LAMP技術(shù)針對原料乳中金黃色葡萄球菌femA基因的8個區(qū)域設(shè)計3對引物進行檢測。全部反應(yīng)在40 min左右完成，檢測限為每毫升菌液8～9個單細胞，檢出率為96.43%。與之相比，應(yīng)用PCR方法的檢出率每毫升菌液8×106個單細胞。同年徐義剛[7]等人，針對金黃色葡萄球菌不同菌株SEA基因設(shè)計4條特異引物，利用LAMP方法進行檢測，檢出率達100%。該方法對純培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌檢測靈敏度為每毫升菌液25個單細胞，對污染食品中金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度為每克菌液中42個單細胞。

2.2 檢測乳品中阪崎腸桿菌

阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）作為食源性條件致病菌，能夠?qū)е氯祟?，尤其是嬰幼兒和免疫力低下者患膿毒血癥、腦膜炎、小腸壞死癥等疾病[8]。目前，檢測阪崎腸桿菌的方法主要為分離培養(yǎng)法，耗時長，F(xiàn)DA于2002年頒布的嬰幼兒乳粉中檢測阪崎腸桿菌推薦方法，檢測周期長達一周[9]，而且不同培養(yǎng)分離方法檢出率差距很大。而應(yīng)用LAMP技術(shù)能夠在5 h之內(nèi)檢測出復(fù)原乳樣品中每毫升菌液中10個單細胞的阪崎腸桿菌，對其基因組DNA的檢測靈敏度達到100 fg[10]。2009年，胡連霞等人[11]用LAMP方法以16S-23S rRNA作為目的基因，在1h之內(nèi)對純培養(yǎng)菌體的檢測限為每毫升菌液0.101個單細胞，對于人工污染嬰兒乳粉的檢測限為每克菌液1.1個單細胞；而作為對比，PCR方法需要3 h的時間完成試驗，檢測限分別為每毫升菌液101個單細胞和每克菌液中1100個單細胞。

2.3 檢測乳中沙門氏菌

沙門氏菌(Salmonella)是引起食品中毒和傷寒的主要致病菌，可以導致人畜共患病。由它引起的食物中毒最為常見，約占食源性食物中毒的75%[12]。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法費時、靈敏度低、操作復(fù)雜且易污染，而LAMP檢測準確率高，比分離培養(yǎng)更快速，比PCR更靈敏。早在2008年朱勝梅等人[13]就將LAMP技術(shù)應(yīng)用于快速檢測牛奶樣品中的沙門氏菌。他們根據(jù)沙門氏菌的特異性invA基因設(shè)計引物進行擴增，檢測靈敏度達到每毫升菌液102個單細胞。2009年Xuefei Li等人[14]在對包括原料乳在內(nèi)的85種食物樣品進行沙門氏菌檢測時發(fā)現(xiàn)，LAMP方法的檢測限可以達到每250毫升菌液35個單細胞，檢測準確性與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法達到100%吻合。并且用LAMP方法進行檢測時全部試驗及結(jié)果分析的時間大約為24h，與此相對傳統(tǒng)PCR方法需要5～7 d。2010年，Xu,Y-G等人[15]利用LAMP方法，針對沙門氏菌的fimY基因進行檢測。他們對包括乳制品在內(nèi)的802個樣品進行LAMP檢測，其中165個樣品LAMP檢測為陽性。并發(fā)現(xiàn)對于純培養(yǎng)的沙門氏菌，LAMP方法的檢測限為每管菌液5個單細胞，對于人工污染食品中沙門氏菌的檢測限為每管菌液9個單細胞。

2.4 檢測乳中單增李斯特菌

單核細胞增生性李斯特氏菌是一種人畜共患的食源性致病菌。在歐美、日本等國家由該細菌引起的食物中毒問題，已經(jīng)超過沙門氏菌排名第一位[16]。WHO將其列為20世紀90年代食品中四大致病菌之一[9]。根據(jù)2010年王德國等人[17]的研究表明，利用LAMP方法對原料乳中單增李斯特菌的IAP基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)對于人工污染的原料乳而言，LAMP方法的檢測限為每毫升菌液186個單細胞，這相當于每個反應(yīng)管中8-10個細胞，并且檢出率為91.67%。而用傳統(tǒng)的PCR方法進行檢測，檢出限為每毫升菌液1.86×105個單細胞?？梢?，LAMP技術(shù)對單增李斯特氏菌檢測靈敏度非常高，并有良好的特異性。

2.5 檢測乳品中大腸桿菌

大腸埃希氏菌（E.coli）通常稱為大腸桿菌，是人和動物腸道的正常寄生性革蘭氏陰性菌，多數(shù)不致病。但某些血清型的大腸桿菌，如腸出血性大腸桿菌，可引起嚴重的胃腸道和循環(huán)系統(tǒng)疾病，嚴重者甚至死亡。傳統(tǒng)微生物學分離、鑒定方法包括選擇性培養(yǎng)、生化和免疫、毒素的細胞學試驗等，耗時長，操作復(fù)雜，而LAMP反應(yīng)不超過1h就能完成。2007年，Yukiko Hara-Kudop[18]等人在檢測食品中大腸桿菌O157和O26時發(fā)現(xiàn)，LAMP方法檢出率約為100%，而用IMS電鍍法和直接電鍍法的檢出率分別為80%和50%。2010年，朱海等人[19]針對大腸桿菌O157:H7建立了LAMP檢測方法，并將該體系應(yīng)用于76份乳制品、肉等人工污染樣品的檢測。研究表明，該體系與國標法的總符合率達到96.1%，且在2 h內(nèi)即可完成檢測。同時用該體系對9屬13種共41株菌進行檢測，發(fā)現(xiàn)只有大腸桿菌O157:H7出現(xiàn)特異性擴增，其他均為產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，檢測靈敏度為每毫升菌液2.7×101個單細胞。

3 LAMP技術(shù)的應(yīng)用前景

綜上所述，與其它方法相比較，LAMP在原料乳及乳制品檢測中具有以下四點優(yōu)勢：(1)特異性強、靈敏度高，對于待檢測的靶細胞模板只需10拷貝亦或更少即可實現(xiàn)大量擴增，屬于超微量檢測技術(shù)。(2)高效快速，只需幾十分鐘即可完成核酸擴增反應(yīng)，不必像PCR等方法一樣需要在反應(yīng)溫度變化上耗費時間。(3)操作簡單，定性檢測只需用肉眼觀察是否出現(xiàn)白色混濁沉淀，就能鑒定擴增與否，無需繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。(4)所需費用低，無需特殊試劑和昂貴復(fù)雜的儀器，利于基層應(yīng)用。

現(xiàn)在已有多個行業(yè)標準采用LAMP作為檢測食源性致病微生物的方法[20]，但LAMP方法亦存在一些缺陷。盡管特異性非常強，但只能鑒別是否擴增，在判斷結(jié)果是否真的出現(xiàn)非特異性擴增時比較復(fù)雜；對靶序列的長度有要求，通常不超過200 bp；原理復(fù)雜，擴增引物設(shè)計過程對研究人員的理論水平要求較高；定量檢測時，也需要使用濁度儀等儀器設(shè)備。因此，許多學者致力于改進和完善這種技術(shù)。為了彌補這些不足，未來LAMP技術(shù)的發(fā)展，需要與其它多種技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)該技術(shù)的創(chuàng)新和飛躍。隨著LAMP技術(shù)的不斷推進，相信在不久的將來，它會在原料乳及乳制品檢測領(lǐng)域有更廣泛和全面的應(yīng)用前景。

[1]孫超,呂彬,余傳奇，等.牛乳的污染及酶法保鮮方法概述[J].中國牛業(yè)科學,2009,35(2):34-36.

[2]曾冰冰,肖凱軍,石磊，等.LAMP方法在食品微生物檢測中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代食品與藥品雜志,2007,17（1）:22-25.

[3]NOTOMI T,OKAYAMA H，MASUBUCHI H,et al.Loop-Mediated Iso2 Thermal Amp Lification of DNA[J].Nucleic Acids Res.,2000, 28(12):63.

[4]陸扁,朱水榮,丁水軍.環(huán)介導等溫擴增PCR技術(shù)檢測金黃色葡萄球具毒素基因的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010,20(5):1088-1089，1097.

[5]GOTO M,HAYASHIDANI H,TAKATORI K，et al.Rapid Detection of Enterotoxigenic Staphylococcus Aureus Harbouring Genes for Four Classical Enterotoxins,SEA,SEB,SEC and SED,by Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay[J].Letters in Applied Microbiology,2007(45):100–107.

[6]WANG D G，HUO G C，CHEN J L，et al.Development and Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)Method for Detecting Staphylococcus Aureus in Raw Milk[J].Milchwissenschaft,2009,64(4):368-371.

[7]徐義剛,李蘇龍,李丹丹，等.食品中金黃色葡萄球菌DNA環(huán)介導恒溫擴增快速檢測方法的建立與應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2010,43(8): 1655-1663.

[8]李秀娟,白萍,徐保紅,等.嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的3種檢測方法比較[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學，2010,37(6):1132-1133,1137.

[9]IVERSEN C,FORSYTHE S J.Comparison of Media for the Isolation of Enterobacter sakazakii[J].Applied and Environmental Microbiology, 2007,73(1):48-52.

[10]魯曦,師寶忠,王彬,等.LAMP法檢測乳粉中的阪崎腸桿菌[J].現(xiàn)代食品科技，2010,5:540-543.

[11]胡連霞,張偉,張先舟,等.改良環(huán)介導等溫擴增技術(shù)快速檢測嬰兒配方奶粉中的阪崎腸桿菌[J].微生物學報,2009,49(3):378-382.

[12]劉偉,姜毓君,呂琦,等.原料乳中沙門氏菌的快速過濾富集及PCR檢測[J].中國乳品工業(yè)，2007,35(7):42-45.

[13]朱勝梅,吳佳佳,徐馳，等.環(huán)介導等溫擴增技術(shù)快速檢測沙門菌[J].現(xiàn)代食品科技，2008,24(7):725-730.

[14]LI X F,ZHANG S.A loop-Mediated Isothermal Amplification Method Targets the phoP Gene for the Detection of Salmonella in Food Samples[J].International Journal of Food Microbiology,2009, 133:252-258.

[15]XU Y G,CUI L C,YANG J H,et al.Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method with Fimy Gene for Rapid Detection of Salmonella in Food[J].Chinese Veterinary Science,2010, 40(5):452-458.

[16]袁耀武,張亞爽,馬曉燕，等.LAMP檢測單核細胞增生性李斯特氏菌的研究[J].中國食品學報,2009,9(3):168-172.

[17]WANG D G,HUO G C,REN D X,et al.Development and Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)Method for Detecting Listeria monocytogenes in Raw Milk[J].Journal of Food Safety,2010,30(2):251-262.

[18]YUKIKO H K,NORIKO K,KAYOKO O,et al.Detection of Verotoxigenic Escherichia coli O157 and O26 in Food by Plating Methods and LAMP Method:A Collaborative Study[J].International Journal of Food Microbiology,2008,29:156-161.

[19]朱海,呂敬章,范放，等.E.coli O157:H7 LAMP檢測方法的建立[J].分子診斷與治療雜志,2010,2(2):98-101.

[20]江迎鴻,劉垚,譚貴良,等.LAMP技術(shù)及其在食品安全檢測中的應(yīng)用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2001,7:220-222.

Application of LAMP technique for detection of pathogenic bacteria in raw milk and dairy products

HU Hui-zhi1,2,MAN Chao-xin1,JIANG Ya-nan2,YANG Shi-qin2,XIE Kun-hao2,JIANG Yu-jun1,2
(1.National Dairy Engineering&Technical Research Center,Harbin 150086,China;2.Key Dairy Science Laboratory of Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)as a novel method has been used to rapidly detect pathogenic bacteria in raw milk and dairy products.Its advantages include easy operation,rapid detection and strong specificity,which is the reason to be widely used to detect pathogenic bacteria in dairy at present.This paper reviewed the principle,identifying and detection methods of LAMP,as well as its applications in raw milk and dairy products detection.

LAMP;milk;detection

TS252.7

B

1001-2230（2011）06-0055-03

2011-01-14

國家科技支撐計劃項目（2009BADB9B06）。

胡惠秩（1985-），女，碩士，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。

姜毓君