改良三維試驗與PCR法檢測川東北地區產“超-超廣譜”β-內酰胺酶革蘭陰性桿菌

袁 斌，周岐新（重慶醫科大學藥學院藥理教研室，重慶市400016）

產生β-內酰胺酶是革蘭陰性桿菌重要耐藥機制之一。AmpC酶與超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）作為當前最具臨床意義的β-內酰胺酶，具有極高的研究價值。有學者將細菌同時產生質粒型AmpC酶和ESBLs定義為超-超廣譜β-內酰胺酶（SSBLs）[1]。我們通過三維試驗檢測在川東北地區是否也存在同時產質粒介導AmpC酶和ESBLs的高度耐藥菌株，通過聚合酶鏈式反應（PCR）實驗確定AmpC酶與ESBLs基因型，建立一種可靠的實驗室檢測產SSBLs方法，指導臨床合理用藥，防止產SSBLs株的區域性流行。

1 實驗材料

1.1 菌株

收集自2008年1月－2009年6月從川北醫學院附屬醫院臨床分離革蘭陰性桿菌237株（非同一患者同一部位重復分離）。所有菌株均經過法國生物梅里埃公司的Vitek 32全自動微生物鑒定儀進行鑒定。質控菌株：標準質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，肺炎克雷伯菌ATCC 700603為ESBLs陽性對照菌，由四川抗菌素工業研究所提供；陰溝腸桿菌029M為AmpC酶陽性對照菌，E.coli C600為川北醫學院藥理教研室李萇清博士惠贈。

1.2 試劑

氨芐西林（AMP）購自中國藥品生物制品檢定所，頭孢西丁（FOX）購自海南輕騎海藥股份有限公司，頭孢曲松（CRO）購自上海新先鋒藥業有限公司，氨曲南（AZ）購自重慶圣華曦藥業，阿米卡星（AMK）購自江蘇吳中實業股份有限公司，亞胺培南（IMP）購自默沙東制藥有限公司，頭孢他啶（CAZ）、頭孢哌酮（CPZ）、頭孢噻肟（CTX）和頭孢哌酮/舒巴坦（CPZ/SB）由哈藥集團制藥總廠提供，哌拉西林（PIP）購自齊魯制藥廠，頭孢吡肟（FEP）購自施貴寶制藥有限公司，左氧氟沙星（LEV）購自山西威奇達藥業有限公司，哌拉西林/他唑巴坦（PIP/TZ）購自珠海聯邦制藥股份有限公司，克拉維酸（CA）、氯唑西林（CLO）購自中國藥品生物制品檢定所；頭孢噻肟紙片（30 μg/片）購于北京天壇藥物生物技術開發公司；PCR反應系統（天根生化科技有限公司）。

1.3 儀器

Sakuma MIT-P細菌多點接種儀（日本佐久間公司）；PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 MIC實驗

采用瓊脂二倍稀釋法，判斷標準依照2008年美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）抗菌藥物敏感性試驗稀釋法標準作為判斷。

2.2 改良三維試驗

采用超聲破碎法制備分離菌株β-內酰胺酶粗提液；涂布大腸埃希菌ATCC 25922的M-H平板中央貼上CTX紙片，然后在距CTX紙片邊緣5 mm處用刀片作放射狀向外切4個裂隙（分別編號A、B、C、D），在4個裂隙中分別加入待測酶粗提液30 μL；酶粗提液30 μL+2 mmol·L－1CA溶液10 μL；酶粗提液30 μL+2 mmol·L－1CLO 溶液 10 μL；酶粗提液 30 μL+2 mmol·L－1CA 溶液 10 μL+2 mmol·L－1CLO 溶液 10 μL。37℃過夜培養。平板若在裂隙與CTX紙片交界處出現矢狀的細菌生長區域者判為陽性，反之則為陰性。A、C號裂隙陽性為單產ESBLs；A、B號裂隙陽性為單產AmpC酶；A、B、C號裂隙陽性為同時產ESBLs與AmpC酶。A、B、C、D號裂隙皆為陰性則為陰性結果。

2.3 質粒結合實驗

以E.coli C600作為受體菌，以同時產ESBLs與AmpC酶的陽性菌株作為供體菌，參考文獻[2]操作。

2.4 PCR法擴增耐藥基因

堿裂法提取結合試驗結合子的質粒DNA，以其為模板，參考文獻[3，4]，擴增編碼ESBLs的基因SHV、TEM、CTX-M、OXA；擴增編碼 AmpC 酶的基因 MOX、CIT、DHA、ACC、FOX、ACT。所有PCR擴增產物送上海英駿生物技術有限公司測序。

3 結果

3.1 MIC測定結果

臨床分離革蘭陰性桿菌對抗生素耐藥率詳見表1。

由表1可見，臨床分離革蘭陰性桿菌對多種抗生素存在著較高的耐藥率，僅對IMP耐藥率較低。篩選出同時對FOX和CAZ耐藥菌株105株。

3.2 三維試驗結果

參見圖1～圖4，三維試驗得到同時產ESBLs與AmpC酶細菌共6株，單產ESBLs菌株26株，單產AmpC酶菌株12株。同時，未測得酶型與陰性結果也較高，分別占20.3%與10.9%（見表2）。

3.3 質粒結合實驗結果

6株三維試驗提示，同時產ESBLs與AmpC酶菌株質粒結合實驗結果為2株細菌結合實驗成功，分別為大腸埃希菌和陰溝腸桿菌。

3.4 PCR結果

以質粒結合成功2株菌株結合子提取質粒為模板，分別以通用引物SHV、CTX、ACT和TEM、CTX、ACT擴增出陽性結果，并與目標條帶吻合。

4 討論

革蘭陰性桿菌是目前引發醫院感染的主要病原體，約占60%～70%[5]。革蘭陰性桿菌耐藥機制復雜，但一致認為，產β-內酰胺酶為革蘭陰性桿菌重要的耐藥機制之一。在所產β-內酰胺酶中，又以ESBLs與AmpC酶最為主要，日益受到大家的關注。

表1 臨床分離革蘭陰性桿菌對抗生素耐藥率情況（%%）Tab 1 Drug resistance rate of clinical isolated gram-negative bacteria to antibiotics（%%）

圖1 三維試驗陰性Fig 1 Negative producing ESBLs of three-dimensional test

圖2 三維試驗ESBLs陽性Fig 2 Positive producing ESBLs of three-dimensional test

圖3 三維試驗AmpC酶陽性Fig 3 Positive producing AmpC of three-dimensional test

圖4 三維試驗同時產ESBLs與AmpC酶陽性Fig 4 Positive producing ESBLs and AmpC of threedimensional test

表2 三維試驗結果統計表Tab 2 Results of modified three-dimensional test

ESBLs是可以水解青霉素類、頭孢菌素與單環內酰胺類抗生素的一類β-內酰胺酶，主要由質粒介導，因此可在不同菌株之間轉移與傳播[6]。依據2001年Bradford分類方法[7]，可以把ESBLs分成5類：SHV型、TEM型、OXA型、CTX-M型及其他型。自ESBLs首次報道以來，目前已發現超200種的ESBLs[8]。AmpC酶與ESBLs不同，通常是由染色體負責編碼。自1988年發現了首個由質粒介導的源于陰溝腸桿菌的AmpC酶以來，目前共發現約30種AmpC酶[9]。最近，國內也開始相繼出現發現質粒介導AmpC酶的報道。朱斌等[10]首次報道了在國內發現銅綠假單胞菌中存在有質粒介導CMY-7型AmpC酶。王輝等[11]報道了在北京地區發現同時產DHA-1質粒AmpC型及CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶的肺炎克雷伯菌。另外，在大腸埃希菌等菌種中也檢測出新型的AmpC酶亞型[12]。隨著報道的增多，由質粒介導的AmpC酶在細菌之間的傳播趨勢已出現。

SSBLs相較ESBLs與AmpC酶，降解底物譜更加廣泛，水解率更高。實驗結果表明，產SSBLs細菌對除碳青霉烯類之外的所有β-內酰胺類抗生素全耐藥。由于β-內酰胺酶由質粒介導，其耐藥性相較染色體介導更易在不同菌株、菌種乃至不同菌屬中傳播，因此，其研究具有重要的流行病學價值[13]。因此，對產SSBLs菌株的快速、及時檢測，以及對其耐藥譜進行分析，對于防控因其引起的院內感染的傳播流行具有重要的指導意義。近年來，國內許多地區相繼報道有臨床分離產SSBLs革蘭陰性桿菌出現[10～20]。但未見本地產SSBLs菌株分離報道。

本研究選擇臨床分離的237株革蘭陰性桿菌作為實驗對象，進行革蘭陰性桿菌臨床分離株耐藥現狀研究，結果表明，本地臨床分離革蘭陰性桿菌耐藥現象嚴重；基于SSBLs具有水解第3代頭孢菌素與頭霉素類的特點，同時篩選出對CAZ與FOX 2種抗生素均耐藥的革蘭陰性桿菌105株，再經改良三維試驗、質粒結合實驗和PCR實驗等進行篩選確證。在237株菌中發現2株產SSBLs細菌，表明本地存在產SSBLs革蘭陰性桿菌所引起的感染，存在此類菌株在院內傳播流行的可能。產SSBLs的2株細菌均產生至少2類ESBLs，分別為CTX-M、TEM與CTX-M、SHV，與當地以往報道相符[21]；同時，這2株菌株的質粒均含有產生ACT型AmpC酶基因。該結果表明，研究菌株產SSBLs菌株質粒均編碼ACT型AmpC酶，依照不同菌屬染色體AmpC酶的同源關系判斷，該型酶屬于腸桿菌屬群，這是首次報道本地區發現質粒編碼AmpC酶。改良三維試驗與PCR法可用于產SSBLs革蘭陰性桿菌篩選與確證。

（致謝：本研究得到了川北醫學院附屬醫院微生物室在菌株收集與鑒定工作中的幫助，謹致謝意！）

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