全自動免疫組化儀的應用及影響其染色質量的因素探討

虞 杰，石偉強

（1.蘇州大學附屬第一醫院病理科；2.蘇州大學醫學部，江蘇蘇州 215123）

全自動免疫組化儀的應用及影響其染色質量的因素探討

虞 杰1,2，石偉強1

（1.蘇州大學附屬第一醫院病理科；2.蘇州大學醫學部，江蘇蘇州 215123）

目前，在免疫組織化學染色中，全自動免疫組化儀越來越多地得到應用。與傳統手工操作方法相比，它具有精確、科學、靈活、方便、高效、環保的特點，優勢明顯。同時，新設備的使用也帶來了很多新的問題，對染色結果存在很多新的影響因素。對全自動免疫組化儀的這些優勢和不足進行探討，有利于更好地保證染色質量，從而進一步保證診斷的準確性。

全自動免疫組化儀；染色質量；應用；影響因素

免疫組織化學染色一直是病理診斷的重要輔助手段，近年來，隨著免疫組織化學新抗體的不斷出現，免疫組織化學也正逐漸走出單一的輔助常規病理診斷的角色，發展為科學研究、判斷病人愈后以及協助臨床用藥的重要輔助手段。新的定位與責任對免疫組化結果的準確性、穩定性要求也隨之提高，因此，制片質量的高低顯得更為重要。近年來，各種型號自動免疫組化儀投入應用，這一更精確、更科學、更靈活、更方便、更高效、更環保的免疫組化染色方式正在被越來越多的醫療機構、科研院所所接受。新設備的運用使得以往手工操作方式下免疫組織化學染色的很多影響因素得到解決。但是，它的使用同時也帶來了一些新的問題，有待得到有效解決。本科室自2010年起使用美國羅氏公司BenchMark XT全自動免疫組化儀，對其優勢及影響其染色結果的具體因素進行了一些歸納和總結。

1 材料與方法

1.1材料儀器與試劑 選取我院2010年1月到2011年6月淋巴瘤組織標本30例及乳腺癌組織標本各20例，美國羅氏公司BenchMark XT全自動多功能組織病理檢測系統主機（包含檢測試劑模塊、染色模塊、散裝液體模塊及廢液收集模塊），此外還有與之配套的惠普計算機及專業操作軟件（VENTANA Medical System-BenchMark XT IHC/ISH Stainingmodule）、激光條碼標簽打印機(VENTANA)。試劑選用DAKO公司的濃縮型一抗以及儀器系統配套的250次檢測試劑盒（主要包括二抗、DAB顯色系統、蘇木素返藍復染系統等）、脫蠟液、液體封蓋膜、氯化鈉檸檬酸鈉、reaction buffer、CC1細胞預處理液、CC2細胞預處理液等。

1.2 方法 選用15種淋巴瘤及乳腺癌常用抗體分別進行手工及全自動免疫組化儀染色，10%中性福爾馬林固定，一般以4-6h為宜，最長不超過24h，常規包埋組織石蠟塊，常規切片（4-6um）并將切片撈于預先經過2%APES丙酮處理過的防脫玻片上，60℃烘箱烘干1-2h以上。

手工染色方法采用Elivison兩步法進行染色。

自動染色方法使用專業電腦操作程序（VENTANA Medical System-BenchMark XT IHC/ISH Stainingmodule）將日常使用的指標一一進行染色流程的編輯設置（主要是各種染色試劑信息：是否由機器脫蠟、復染；是否自動滴加一抗、脫蠟、抗原修復；設定一抗、二抗、復染的時間和溫度等）并保存。

配制各種常用一抗，充填于與主器配套的專門試劑瓶，編輯掃描試劑瓶上的激光條碼，使之與之前所保存的相應指標的染色流程相聯。

掃描系統配套的250次檢測試劑盒（主要包括二抗、DAB顯色系統、蘇木素返藍復染系統等），并將其安裝于可拆分試劑架上。

將儀器廠家配套的主機散裝液體模塊中的各種試劑（包括脫蠟液、液體封蓋膜、氯化鈉檸檬酸鈉、reaction buffer、CC1細胞預處理液、CC2細胞預處理液等）按說明書要求比例進行調配，并充填于主機相對位置的試劑瓶中。所有的試劑使用前都要通過激光條碼掃描系統預先確認。

編輯打印防水條碼切片標簽（包括免疫指標、病理號、免疫號、送檢醫院等病人信息），粘貼于切片一側。將切片分別置于染色模塊中的獨立溫控切片位上。再將裝有一抗及儀器配套檢測試劑盒的試劑架安裝于主機旋轉式試劑臺上。點擊電腦操作軟件中的“RUN”鍵設定本次染色切片數（1-30張），并根據需要選擇是否設定延遲染色開始或結束時間，點擊確定開始程序，此后所有染色工作均由機器自動完成。

自動染色程序完成后，取出切片插入切片架，用洗潔精清洗切片上的殘余油膜和試劑，清水沖洗，之后梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

2 結果及優勢

2.1 本系統對每種抗體都專門設定了獨立詳細的染色流程，抗體滴加完全由系統通過激光掃描條碼確認執行，每一張切片每一步的反應條件都可以得到精確控制。與手工染色結果比較分別見表1和圖1-圖4。

由表1和圖1-4可見，全自動免疫組化儀染色有效避免了人工操作條件下的錯誤，染色結果的均一性和可重復性得到了保證，染色結果強度較高，著色均勻，定位準確，背景清晰，無邊緣效應，整體上比較令人滿意。

2.2 通過對染色開始時間及結束時間的合理設置，可以較為有效地解決該系統每批次處理切片數量較少的不足，從而提高工作效率。

2.3 全自動的染色過程，大幅度節約了人力，使實驗操作人員得以科學安排工作，提高了工作效率。

2.4 由于使用的試劑中不含有二甲苯以及系統對廢液中毒性較強的DAB的合理處理，大大減少了有毒物質對實驗操作者身體的危害，增加了環保性和安全性，提升了實驗室工作環境質量[1]。

3 染色結果的影響因素

3.1 組織的前期處理 固定時間要嚴格控制，一般以4-6h為宜，最長不超過24h，過長過短都會對染色結果產生不良影響。研究表明，組織固定時間不足易造成組織結構不清和抗原彌散，固定時間過長則會破壞或封閉組織的抗原活性，影響染色結果[2]。

3.2 切片的質量 良好的切片質量是保證染色質量的基本要求，切片要盡量做到平整，厚度適宜(4-6um)，盡量避免刀痕皺褶，有研究表明，刀痕和皺褶部位易引起假陽性[3]。應在切片前對組織蠟塊進行-20°C左右低溫冰凍3-5min，擰緊切片機各部位固定螺栓，切片時盡量避開刀鋒缺口部位及使用新刀片，可有效避免刀痕和皺褶。

3.3 涂膠片的制備 脫片會直接影響染色結果。因此前期對玻片的處理是做好免疫組化的重要前提之一，最好使用涂膠玻片，防脫片效果較好。目前免疫組織化學染色中兩種防脫片劑多聚賴氨酸（Poly-L-Lysine）和APES較為常用。多聚賴氨酸防脫片原理主要是通過多聚陽離子分子與組織切片上的陰離子相互作用產生較強的黏合力。而APES則通過化學修飾玻璃表面，改變其物理化學特性從而達到防脫片效果。經過實踐研究表明，經過APES處理的玻片防脫片效果較好[4]。應使用2%APES丙酮預先浸泡玻片1-2min，丙酮浸泡1-2min，再用蒸餾水浸洗1-2min，烤干備用，這樣可以有效防止脫片。

3.4 試劑 抗體的質量是染色成功與否的重要保證，要選擇品牌好、質量過關的試劑，多次實驗表明，基因、邁新、中山等公司的產品使用效果都較為理想。

各種試劑均應嚴格按照廠商要求的濃度比例進行配制，且使用前必須徹底混勻，否則易造成假陰性甚至完全不著色的結果。

多數試劑的最佳保存溫度為4℃左右。溫度過高會引起試劑效價降低。手工方法進行免疫組化染色時，各種抗體試劑只需依次在使用時臨時從4℃冰箱取出滴加，滴加完畢后立即放回冰箱，在外部環境中放置時間較短。使用全自動免疫組化儀染色時，由于旋轉式試劑臺是開放式的，不具備溫度調節功能，整個染色過程的3-4h中，所有試劑都長時間暴露在外部環境中，因此對實驗室的溫度有較高要求。正常情況下實驗室溫度應最好控制在25℃以下，且對于暫時不用的試劑也應及時放入4℃冰箱保存。

3.5 試劑瓶安裝及檢查 雖然本機通過激光條碼掃描識別試劑瓶，對試劑瓶的安裝順序沒有嚴格的要求，但有時機器自檢時并不一定能夠發現試劑瓶安裝位置上的一些細小偏差，會導致程序運行時試劑不能順利通過試劑盤底部的滴加孔滴加到標本上，造成假陰性，因此，在正式運行程序前，必須仔細檢查各個試劑是否安裝到位、準確無誤，確認試劑瓶滴加口是否對準底盤滴加孔。

有些特殊情況下試劑瓶發生泄露，會導致瓶中試劑余量低于系統默認余量；試劑瓶滴加口空氣未能排空，可導致染色程序運行過程中部分試劑無法成功滴到部分或全部切片上，造成染色失敗。因此正式運行程序前必須檢查各試劑瓶中液面高度以及滴加口是否有空氣未被排空。

3.6 其他因素 除以上諸種因素外，還有其他一些因素也應引起注意，如應為系統配置專用不間斷電源，以防止系統運行期間突然斷電造成的損害；由專人定期做好機器的清洗及日常維護保養工作，使之保持最佳狀態；盡量不要在機器配套的電腦上插外來盤或安裝無關軟件，防止計算機病毒侵害或加重系統負擔。

其他一些品牌型號的自動免疫組化儀如美國BioGenex i6000全自動免疫組化染色儀，不具備組織切片脫蠟、抗原修復以及染色后的蘇木素復染、分化、返藍功能，也不具備激光條碼標簽掃描功能，每次染色前都需要操作人員通過系統對組織切片及試劑安裝位置進行一一設置。同時，由于無法調節反應溫度以及無法預先針對各種不同抗體設置獨立染色程序，因此對染色條件也達不到精確控制，切片染色很難達到最佳效果。而沒有經過環保處理過的廢液也會對環境及操作人員的身體造成危害。相比之下，BenchMark XT全自動免疫組化儀很好地解決了上述問題。當然，即使是再先進的全自動免疫組化儀也不是完美無缺的，實驗技術人員豐富的工作經驗以及認真負責的態度同樣是切片染色質量的重要保證。

[1]羅小平,胡維維,伍尚金.全自動免疫組化染色儀與人工操作的比較[J].醫療衛生裝備,2007,28(4):59-60.

[2]梁英杰.免疫組織化學技術制片的規范和質量控制[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2004,13(2):262-264.

[3]陳萍倩,張蓉,陸敏華,等.自動免疫組化染色儀在免疫組化染色中的應用[J].JDiag Pathol,2003,10(4):238.

[4]虞杰,顧冬梅,郭凌川.肪脫片劑在免疫組織化學染色中的應用[J].中國血液流變學雜志,2008,18(3):432-433.

[5]楊月紅,袁靜萍,袁修學,等.自動免疫組化儀的使用體會[J].臨床與實驗病理雜志,2011,27(3):333-334.

[6]姜冰,楊軍,彭長纓,等.全自動免疫組化染色儀在臨床病理的應用[J].中國現代醫學雜志,2008,18(18):2745-2746.

[7]孫琪,李燕,李晶.免疫組化染色質量控制的經驗和體會[J].寧夏醫科大學學報,2010,32(1):146-147.

Investigation for Application and Factorsof Influencing Staining Qualitiesof Immunohistochem istry Autostainer

YU Jie,SHIWei-qiang
(Department of Pathology,ThefirstAffiliatedHospital of SuzhouUniversity,SuzhouJiangsu215006,China)

In current,immunohisto chemistry auto stainerha sbeen applicated in immunohi stoche mistry staining moreand more.Comparew ith traditiona lmanual operation.It has some good ness like accurat escientific flexible convenient efficient environmental.

immunohis to chemistry autostainer;staining qualities；application;influencing factor

R446

A

1671-0142（2011）06-0069-03

虞杰（1979-）,男,江蘇蘇州人,主管技師,在讀碩士研究生,研究方向為病理與病理生理學.

（責任編輯 劉 紅）