殼聚糖山梨酸酯的合成、表征及抑菌活性研究＊

馮永巍,夏文水,張威

殼聚糖是由氨基葡萄糖和 N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的生物大分子聚合物,具有促進傷口愈合、降低膽固醇、抑制微生物生長等多種生理活性[1-3]。由于其低毒、生物可降解、能抑制多種微生物生長的特點,被視為開發高效、無毒新型食品防腐劑的理想基質。與目前廣泛使用的食品防腐劑相比,殼聚糖的抑菌效果比較弱,達不到食品工業中防腐保鮮的要求,是限制其作為防腐劑在食品中應用的主要原因。通過化學改性的方法將強抑菌基團引入殼聚糖分子中提高其抑菌活性,拓寬其抑菌譜是解決這一問題的有效途徑。國內外研究報道顯示,殼聚糖季銨鹽類衍生物、硫脲基衍生物,哌嗪類衍生物以及一些含氯衍生物都具有比殼聚糖更加優良的抑菌活性[4-7]。然而其引入的抑菌基團對人體具有潛在的危害和毒性,不適合在食品體系中應用。

趙希榮、馮永巍等人將對羥基苯甲酸、苯甲酸和富馬酸等常用的食品防腐劑引入到殼聚糖分子中,合成了殼聚糖尼泊金酯、殼聚糖苯甲酸酯、殼聚糖富馬酸酯等一系列的殼聚糖衍生物[8-9]。研究證明,這些衍生物的抑菌活性都遠高于其母體殼聚糖。山梨酸同上述防腐劑相比防腐抗菌能力更強,并且作為一種不飽和脂肪酸進入人體后,參與人體的新陳代謝過程,代謝產物為二氧化碳和水,是一種國際公認安全(GRAS)的防腐劑。本研究擬通過化學改性的方法將山梨酸引入到殼聚糖分子中,制備一種更加安全高效的殼聚糖基食品防腐劑,為殼聚糖類防腐劑的分子設計和應用進行有益的探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖,脫乙酰度 (DD)=85%,相對分子質量 3×105,南通雙林生物有限公司;營養肉湯、馬鈴薯培養基、瓊脂,生化試劑;N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、山梨酸、甲烷磺酸、丙酮、氨水、乙醇等,均為分析純 ,國藥集團化學試劑有限公司;大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcocus aureus)、黑曲霉(Aspergillus niger),均由江南大學食品學院微生物實驗室提供。

SPX型智能生化培養箱,南京實驗儀器廠;RW20 DZ M.n機械攪拌器,上海試驗儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環水多用真空泵,鄭州長城科工貿有限公司;5DDXB FT-IR紅外光譜儀,美國 Nicolet公司;Brucker ARX400核磁共振儀,德國 Brucker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山梨酰氯的制備

稱取干燥的山梨酸 10 g,置于 100 mL三口燒瓶中,加入 SOCl230 mL和 2～3滴二甲基甲酰胺(DMF)。加熱到 60～90℃回流 3 h。反應的尾氣經過 CaCl2干燥管后用 20%NaOH吸收。無尾氣生成表明反應已經結束。將反應液冷卻至室溫,進行減壓蒸餾。真空度保持在 0.08 MPa,除盡未反應的SOCl2,繼續蒸餾至 160℃得到黃色的油狀液體為山梨酰氯。

1.2.2 殼聚糖山梨酸酯的合成

稱取干燥的殼聚糖 1.7 g,加入 25 mL甲烷磺酸0～5℃不斷攪拌 30 min。當殼聚糖完全溶解后,逐滴滴加與氨基葡萄糖單位摩爾比為 1∶1,1∶3,1∶5的山梨酰氯,劇烈攪拌反應 3 h,于 -18℃冷凍過夜。向反應液中加入大量丙酮以沉淀產物。用去離子水溶解沉淀,并用 1 mol/L氨水溶液調 pH值至 7.0,有沉淀析出。采用乙醇索氏抽提沉淀 24h,真空干燥,得到的淡黃色粉末為殼聚糖山梨酸酯。

1.2.3 衍生物的結構表征

1.2.3.1 FTI R光譜

KBr壓片法,在 4 000～400 cm-1范圍記錄樣品的 FITR圖譜。

1.2.3.21H NMR光譜

1.2.3.3 DS的計算

衍生物的游離氨基含量和取代度,依據1H NMR圖譜的數據,按照公式 (1),(2)計算

公式 (1),(2)中,DS:取代度;X:游離氨基比例;B:氨基葡萄糖單位 H-1的積分面積;C:乙酰氨基葡萄糖單位上 H-2和氨基葡萄糖單位上 H-3,4,5,6)積分面積;D:取代基上各個 H積分面積;N:取代基上氫的個數。

1.2.4 抑菌活性的研究

1.2.4.1 抑菌劑溶液的制備

將殼聚糖及其衍生物分別溶解在 1%的乙酸溶液中制成濃度為 25 g/L的抗菌劑溶液備用。1.2.4.2 初始菌液的制備

將活化好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的菌液用生理鹽水稀釋至濃度 107CFU/mL,作為初始菌液。1.2.4.3 霉菌孢子懸液的制備

將活化好的黑曲霉菌種接入三角瓶中,瓶中預先放入少量玻璃珠和經過滅菌的生理鹽水。用力振蕩后,過濾菌液,再用生理鹽水稀釋至濃度 106CFU/mL,即為霉菌孢子懸浮液

1.2.4.4 細菌抑菌率的測定

將 1 mL的初始菌液與 98 mL滅菌后的營養肉湯培養混合,再向其中加入 1 mL抑菌劑溶液,以 1 mL 1%乙酸溶液代替抑菌劑溶液作為空白,37℃振蕩培養。每隔 1 h取出 1 mL培養液,倍比稀釋后涂布平板法計算菌落數,重復 3次。按照公式 (3)計算抑菌率 (η)。

公式中(3)中,N1:空白的中的菌落數;N2:含藥培養液中菌落數。

1.2.4.5 霉菌的抑菌率的測定

將 1 mL黑曲霉孢子懸浮液液加入到 100 mL滅菌后馬鈴薯培養基中,再分別加入 1 mL抑菌劑溶液,以 1 mL 1%乙酸溶液代替抑菌劑溶液作為空白在30℃培養振蕩培養,每隔 6h取出 1 mL培養液,用布氏漏斗抽濾。收集菌絲體,洗凈,置烘箱中烘千后稱重,重復 3次。按照公式 (4)計算抑菌率 (η)。

公式 (4)中,m1:空白培養液中菌絲重量;m2:含藥培養液中菌絲質量。

1.2.4.3 最小抑菌濃度 (M IC)的測定

采用二倍稀釋法[10],將抑菌劑入培養基中制成濃度 1.0,0.5,0.25,0.12 5,0.062 5 g/L的含藥瓊脂平板。將 0.1 mL初始菌液或孢子懸浮液涂布在平板表面,細菌 37℃培養 72h無菌落生長;霉菌 30℃培養3d,無菌絲體生長時的最低的濃度為最小抑菌濃度。

2 結果與討論

2.1 產物的表征

2.1.1 FTIR表征

圖1 殼聚糖和殼聚糖山梨酸酯的 FTIR光譜

圖1 為殼聚糖和殼聚糖山梨酸酯的 FTIR圖譜。在殼聚糖的 FTIR圖譜中,3 430 cm-1處的寬峰可歸屬為殼聚糖分子中大量存在的—OH和—NH2所形成氫鍵的振動吸收,1 665 cm-1處和 1 597 cm-1處的吸收峰分別為酰胺 I和 NH2的特征吸收。與殼聚糖相比,殼聚糖山梨酸酯的 FTIR圖譜在 1710 cm-1處出現了一個新吸收峰可歸屬為不飽和羰基伸縮振動,1 642 cm-1處的新峰為山梨酸分子中位 C=C鍵的特征吸收,1 595 cm-1處 NH2的特征吸峰仍然存在。綜合以上結果可以認為,山梨酰氯與殼聚糖的羥基發生了酯化反應形成一個新的酯鍵,反應活性更強的氨基在反應中得到了較好的保護。

2.1.21H NMR表征

圖2是殼聚糖山梨酸酯的 1HNMR圖譜。各吸收峰的化學位移和歸屬如下:δ=1.82 ppm(s,CH3,H-8);δ=2.24 ppm(s,NHAc,H-7);δ =3.42 ppm(br s,H-2 of GlcN residue H-2);δ=3.63-4.39 ppm(brm,H-3,4,5,6 of GlcN unit);δ=5.02 ppm(br s,H-1 of GlcN residue);δ=5.8 ppm(br,CH,H-9);δ=6.38-6.82 ppm(br,CH=CH,H-10、H-11);δ=7.8ppm(br,CH,H-12)。

圖2 殼聚糖山梨酸酯的1H NMR圖譜

殼聚糖山梨酸酯衍生物的取代度和游離氨基含量見表1。從表1中看出,衍生物的取代度隨山梨酰氯比例的增加而增加。當反應物摩爾比為 1∶5時,取代度接近 2,意味著殼聚糖 C-3位和 C-6位的-OH均發生了酯化。此外,各取代度的衍生物游離氨基含量基本上與母體殼聚糖相同,說明反應主要發生在殼聚糖的羥基,氨基仍以游離形式存在,與紅外表征的結果一致。殼聚糖是大分子聚合物,由于分子中羥基和氨基之間的氫鍵作用,形成致密牢固的結晶結構,不易發生化學反應。殼聚糖在甲烷磺酸中溶解,分子鏈呈舒展狀態,易于酰化反應的進行,并獲得高取代度的產物。反應中甲烷磺酸既作為溶劑和催化劑,又與殼聚糖的游離氨基形成弱鹽,阻止了山梨酰氯對氨基的進攻,使得酰化反應主要發生在殼聚糖的羥基。[10]趙希榮等采用鄰苯二甲酸酐與殼聚糖的氨基反應生成一個中間產物,酯化反應結束后,再用水合肼除出鄰苯二甲酸酐,得到殼聚糖選擇性羥基酯化的產物[8]。與之相比殼聚糖在甲烷磺酸體系中直接選擇性羥基酯化,步驟簡單,效率更高。

表1 山梨酸殼聚糖酯的取代度和游離氨基含量

2.2 殼聚糖山梨酸酯的抑菌活性研究

2.2.1 殼聚糖山梨酸酯的抑制細菌活性

殼聚糖與殼聚糖山梨酸酯對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別見圖3和圖4。

圖3 殼聚糖與殼聚糖山梨酸酯對大腸桿菌的抑制率

圖4 殼聚糖與殼聚糖山梨酸酯對金黃色葡萄球菌的抑制率

從圖3中可以看出,殼聚糖對大腸桿菌的生長有一定抑制作用,培養 8h后抑制率可達到 50%。不同取代度殼聚糖山梨酸酯對大腸桿菌的抑制作用均強于殼聚糖,其抑菌活性的強弱的順序為 a＞b＞c。取代度為 1.21的殼聚糖山梨酸酯的抑菌活性最高,培養 2 h抑菌率就可以達到 88%,培養 5h即可完全抑制大腸桿菌的生長。殼聚糖氨基攜帶的正電荷可與微生物細胞表面攜帶的負電荷發生相互作用,引起細胞內容物泄露,是殼聚糖抑制微生物生長的作用機理。山梨酸與殼聚糖的羥基發生酯化反應,在保留了殼聚糖的活性氨基的同時形成了一個了α,β-不飽和的羰基結構,這是一種具有高效抑菌活性的化學結構,因而提高了殼聚糖的抑菌性。隨著取代度的增加,衍生物的抑菌活性也隨之增強。值得注意的是:當取代度為 1.93時,抑菌活性反而有所下降,這可能是因為山梨酸是疏水性物質,當取代度接近 2時,糖環上的親水性的羥基都被取山梨酸所酯化,致使衍生物的疏水性過大,不利于衍生物與水相中微生物的之間的接觸;另一方面高取代度也可能導致衍生物抑菌基團周圍空間位阻的增加,影響其發揮抑菌作用。圖4中可以看出,衍生物對金黃色葡萄球菌抑菌活性隨取代度變化的規律與大腸桿菌相類似。此外,衍生物對金黃色葡萄球菌的抑制活性要略強于大腸桿菌,各取代度的衍生物在 8h內都可以完全抑制金黃色葡萄球菌的生長。

2.2.2 殼聚糖山梨酸酯的抑制霉菌活性

殼聚糖及殼聚糖山梨酸酯對黑曲霉的抑菌率見圖5。

圖5 殼聚糖與殼聚糖山梨酸酯對黑曲霉菌的抑制率

從圖5中可以看出,殼聚糖對黑曲霉的基本沒有抑制作用。而各取代度的衍生物都對黑曲霉有比較強的抑制作用。抑菌活性的強弱的順序為 a＞b＞c。許多真菌的細胞壁成分中都含有殼聚糖的前提甲殼素,對殼聚糖的抑制作用表現出一定的抗性。在試驗中也得到了相同的結果。相反,山梨酸是一種很強的防霉劑,通過酯化反應引入到殼聚糖分子中大大提高了殼聚糖對黑曲霉的抑制活性。取代度 1.21的衍生物在培養 24 h后對黑曲霉的抑菌率可達到 60%。48 h后可完全抑制黑曲霉的生長。

2.2.2 殼聚糖山梨酸酯對 3種微生物的M I C

殼聚糖及殼聚糖山梨酸酯 (DS=1.21)對 3種微生物的M IC值見表2。從表2中可以看出,殼聚糖山梨酸酯(DS=1.21)的對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都是 0.125 g/L。僅為殼聚糖的M IC值的 1/4。在試驗濃度下,未檢出殼聚糖對黑曲霉的最小抑菌濃度,而殼聚糖山梨酸酯 (DS=1.21)對黑曲霉的最小抑菌濃度為 0.5 g/L。Kanatt等通過美拉德反應制備了殼聚糖葡萄糖衍生物,其對食品中的致病細菌的M I C為 0.05%,該衍生物可以延長冷凍肉類的貯藏期 3周[11]。于沛沛合成的殼寡糖苯甲酸酯,對大腸桿菌的M I C為 0.02%～0.04%金黃色葡萄球菌的M I C為0.02%～0.29%。對黑曲霉菌的 M IC為 0.2%[12]。趙希榮合成的殼聚糖尼泊金酯對大腸桿菌和金黃色葡萄菌的M I C分別為 0.025%和 0.01%在牛奶和果汁制品中添加都可以顯著提高其保質期。相比以上幾種衍生物殼聚糖山梨酸酯的最小抑菌濃度更低,也就是說其對微生物的抑制活性也更強,更加具備作為食品防腐劑的應用潛力。

表2 殼聚糖與殼聚糖山梨酸酯對 3種微生物的M IC

3 結論

本研究采用甲烷磺酸為催化劑和氨基保護劑,酯化合成羥基取代的殼聚糖山梨酸酯。抑菌實驗結果表明衍生物的對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑制作用由強到弱依次為:殼聚糖山梨酸 (DS=1.21)＞(DS=1.93) ＞(DS=0.44)。取代度為1.21的衍生物對 3種微生物的最小抑菌濃度分別為0.125、0.125和 0.5 g/L。該衍生物不僅提高的殼聚糖的抑菌活性,同時也擴大了殼聚糖的抑菌譜。

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