超聲波輔助提取月柿原花青素及其純化

李仁杰,陳錦屏,張娜,嚴靜,王恒超

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西西安,710062)

超聲波輔助提取月柿原花青素及其純化

李仁杰,陳錦屏,張娜,嚴靜,王恒超

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西西安,710062)

研究了超聲波輔助提取月柿生理落果原花青素工藝。適宜工藝條件為:超聲波功率 150 W、提取溶液乙醇體積分數 70%、料液比 (g∶mL)1∶12、提取時間 15 min、提取溫度 45℃。通過對 9種大孔吸附樹脂的研究,確定LS300樹脂為優選純化樹脂。研究了原花青素在LS300樹脂上的吸附行為,靜態吸附研究表明,其吸附等溫曲線符合 Freundlich等溫吸附方程,吸附平衡的時間約為 5h。乙醇濃度梯度洗脫試驗表明,原花青素主要易被體積分數 20%、40%乙醇溶液洗脫,兩部分原花青素質量分數分別為 86.5%、92.3%。

原花青素,月柿生理落果,超聲波輔助提取,大孔吸附樹脂,純化

月柿屬于柿樹科柿屬,喬木落葉性果樹。主產于中國廣西壯族自治區恭城瑤族自治縣,已有 400多年的栽培、加工歷史[1]。恭城月柿現種植面積 0.669萬hm2,年產柿餅 1萬 t。在月柿生長過程中每年 7、8月都會產生大量的生理落果,造成資源浪費與環境污染。由于月柿中含有大量的原花青素[2],所以可利用這些生理落果提取原花青素。原花青素是一種由黃烷醇單體縮合而成的聚多酚類物質,原花青素具有極強的抗氧化等活性,已廣泛應用于食品、藥品、化妝品等領域[3-4]。本文利用月柿生理落果為原料,對超聲波輔助[5]提取月柿生理落果原花青素的工藝及用大孔吸附樹脂純化原花青素的工藝進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

月柿生理落果,2009年 7月采于恭城紅巖村柿園,采收后立即運回實驗室冷凍貯藏;原花青素標品,天津尖峰天然產物公司生產;LS46、LS100、D101、LS300、LS300B、LS306、LS600、LS610、LS800大孔吸附樹脂,陜西藍深樹脂有限公司;乙醇、鹽酸、甲醇、香草醛均為國產分析純。

舒美 KQ3200DE型實驗室用超聲波清洗器 (功率 150 W,頻率 40 KHz,溫度、功率均可調),昆山超聲儀器公司;Sartorius BS224型電子天平,北京賽多利斯 (Sartorius)儀器系統有限公司;SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵,鄭州長城科工貿有限公司;722型可見分光光度計,上海光譜儀器有限公司;MB99-2自動分離層析儀,上海滬西分析儀器有限公司;SHZ-82型恒溫水浴搖床,金壇市富華儀器有限公司;RZ-52旋轉蒸發器,上海安亭實驗儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 月柿生理落果原花青素提取工藝

月柿生理落果→組織搗碎機搗碎→準確稱取5.00 g→加入提取溶劑→超聲波輔助提取→提取液真空抽濾→真空濃縮提取液→冷凍干燥

1.2.2 原花青素提取率的計算

Y:原花青素的提取率,%;V0:提取溶液的體積,mL;c0:提取溶液原花青素的濃度,mg/mL;m0:月柿落果質量,g;Z:原花青素提取效果,mg/g。

1.2.3 樹脂靜態吸附試驗流程

將一定質量預處理好的樹脂加入錐形瓶中,加入原花青素提取液,密封,置于水浴搖床中,進行吸附試驗,試驗結束后測定溶液中原花青素的濃度。

吸附試驗完成后將樹脂與原花青素分離 (樹脂繼續留在錐形瓶中),在錐形瓶中加入洗脫溶液,密封,置于水浴搖床中進行解吸試驗,試驗結束后測定溶液中原花青素的濃度。

1.2.4 樹脂動態吸附試驗流程

將預處理好的樹脂濕法裝柱,加入原花青素提取溶液。待原花青素充分吸附后,用蒸餾水將沒有吸附的原花青素沖出,然后用不同乙醇濃度的洗脫液進行梯度洗脫,收集洗脫液,將洗脫液真空濃縮、冷凍干燥,并測定原花青素濃度。

2 試驗結果與討論

2.1 標準曲線繪制

取濃度分別為 0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的原花青素甲醇溶液 1 mL于具塞試管中,各加入質量分數 1%的香草醛甲醇溶液 2.5 mL與 8%的鹽酸甲醇溶液 2.5 mL,用橡皮塞塞緊試管,置于 30℃水浴鍋中避光保溫 30 min,保溫結束后冷卻至室溫,在500 nm下測量吸光值[6],并繪制標準曲線。得到回歸方程為:y=0.001 6x-0.006,R2=0.997 4。

圖 1 原花青素標準曲線

2.2 超聲波功率單因素試驗

選擇超聲功率為 90、105、120、135、150 W 5個單因素進行試驗,其他實驗條件為:溫度 55℃、提取時間 10 min、提取液乙醇體積分數 50%、料液比 1∶12。

圖 2 超聲功率單因素試驗

從圖 2中可以看出,當超聲波功率為 90～150 W時,提取率逐漸升高,這可能是由于超聲波功率增大加快了植物細胞的破碎,更有利于原花青素的提取[5]。

2.3 提取溶液乙醇濃度單因素試驗

原花青素的分子中含有大量羥基,易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑,但有機溶劑滲透性較差,通常選擇有機溶劑的水溶液作為提取溶劑[7],本試驗選擇毒性較低的乙醇水溶液作為提取溶劑。

選擇提取溶液乙醇體積分數為 40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%5個單因素進行試驗,其他的實驗條件為:提取溫度 55℃、提取時間 15 min、超聲波功率 150 W、料液比 1∶12。

從圖 3中可以看出,隨著乙醇濃度的增大原花青素提取率逐漸增大,但乙醇體積分數超過 70%后,提取率隨乙醇濃度的升高逐漸降低。

2.4 提取時間單因素試驗

選擇提取時間 5 min、10 min、15 min、20 min、25 min 5個單因素進行試驗,其他實驗條件為:超聲波功率 150 W、提取溫度 55℃、提取溶液乙醇濃度70%、料液比 1∶12。

圖 3 提取溶劑乙醇濃度單因素試驗

圖 4 提取時間單因素試驗

從圖 4中可以看出,當提取時間為 15 min時提取率最高,15 min以后隨著提取時間的增加提取率隨著時間的增加反而降低。這可能是由于較短的提取時間不能使原花青素得到充分浸提,較長的提取時間又會造成原花青素氧化分解的緣故。

2.5 料液比單因素試驗

選擇液料比 1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16進行單因素試驗,其他試驗條件為:超聲波功率150W、提取溫度 55℃、提取溶液乙醇體積分數 70%、提取時間 15 min。

從圖 5中可以看出,隨著液料比的增大,提取率逐漸增大,液料比為 12∶1時提取效果達到最大,液料比繼續增大提取率則開始下降。這可能是由于較小的液料比無法充分浸提出原花青素,較大的料液比造成了液體過多地吸收了超聲波使,使作用于原料的超聲波減小的緣故。

2.6 提取溫度單因素試驗

圖 5 料液比單因素試驗

選擇 25、35、45、55、65℃5個溫度為單因素進行試驗,其他實驗條件為超聲波功率 150 W、提取時間15 min、提取溶液乙醇體積分數 70%、料液比 1∶12。

從圖 6可知,隨著溫度的升高,提取率不斷增大,到 55℃時提取率達到最大,繼續升高溫度,則提取率開始下降。可能是由于溫度升高加速細胞破裂并有利于原花青素充分溶解于提取溶液,但原花青素是熱敏性物質,高溫又會使其分解加快的緣故。

圖 6 提取溫度單因素試驗

2.7 超聲波輔助提取正交試驗

在單因素試驗的基礎上選擇提取溫度 (A)、提取時間 (B)、料液比 (C)三因素在三個水平上進行正交試驗,試驗中其他試驗條件為超聲功率 150 W、提取溶劑乙醇體積分數 70%。

從表 2中可以看出,原花青素最佳提取條件為A1B2C2,由此得出最佳提取條件為:提取溫度 45℃、提取時間 15 min、料液比為 1∶12、超聲波功率 150W、提取溶劑乙醇濃度 70%。從極差分析可以看出 3個因素對原花青素提取效果影響的主次順序為 B(提取時間)>C(料液比)>A(提取溫度)。

表1 L9(33)正交因素水平表

表2 正交試驗結果分析

表3 正交試驗方差分析

從表 3中可以看出,A(提取溫度)、B(提取時間)、C(料液比)3個因素對提取效果的影響均顯著。

2.8 大孔吸附樹脂選擇試驗

試驗選擇 LS46、LS100、D101、LS300、LS300B、LS306、LS600、LS610、LS800九種大孔吸附樹脂進行樹脂選擇試驗,從中選擇一種吸附能力與解吸能力俱佳的樹脂。

各加入上述 9種樹脂 10 g于錐形瓶中,分別加入 20 mL濃度為 0.226 3 mg/mL原花青素溶液,將錐形瓶置于水浴搖床中進行吸附試驗,實驗條件為:溫度 40℃、轉速 120 r/min、時間 24 h。然后測定溶液中原花青素濃度 c1。將樹脂與原花青素溶液分離 (樹脂繼續保留在錐形瓶中),加入乙醇體積分數為 50%洗脫液 20 mL,在水浴搖床中進行解吸試驗,試驗條件為:溫度 40℃、轉速 120 r/min、時間 24 h,然后測定洗脫液中原花青素濃度 c2。計算各樹脂吸附能力與解吸率。

W:樹脂吸附能力,mg/g;m1:樹脂質量,g;n:樹脂解吸率,%。

表4 樹脂型號與樹脂編號

圖 7 樹脂選擇試驗

從圖 7中可以看出,吸附能力最強的是 5號樹脂即 LS300B樹脂,但 LS300B樹脂解吸率太低,會造成吸附上去的原花青素無法被洗脫下來,所以綜合吸附能力與解吸率,選擇 4號樹脂即 LS300樹脂繼續進行原花青素純化的實驗。

2.9 吸附速率試驗

在錐形瓶中加入 5 g處理好的 LS300樹脂,然后分別加入初始濃度分別為 1.87、3.52、6.82 mg/mL原花青素提取液,置于 40℃的水浴搖床中震蕩 (120 R/min),每隔 1h測定錐形瓶內的原花青素濃度,計算原花青素在樹脂上的吸附量。

Q:原花青素在樹脂上的吸附量 mg/g,c:溶液原花青素的初始濃度 mg/mL,c4:t時刻原花青素溶液濃度 mg/mL,V1:溶液的體積 mL。

圖8 吸附速率試驗

從圖 8中可以看出,在吸附初始階段吸附量增加明顯,吸附較快,隨后吸附量增加逐漸減慢,吸附 5 h后吸附量趨于穩定,故吸附平衡所需時間為 5 h。

2.10 吸附平衡試驗

稱取 5 g樹脂加入到錐形瓶中,分別加入不同濃度的原花青素提取液 100 mL,置于恒溫搖床中震蕩實驗條件為:溫度 40℃、轉速 120 r/min、時間 6 h。6 h后取出測定溶液中原花青素的濃度。測定 30、40、50、60℃時的吸附等溫曲線。用 Freundlich方程:Q=kc1/n擬合所得數據[8]。

圖 8 吸附平衡試驗

表5 Freundlich等溫吸附方程擬合結果

2.11 動態吸附試驗

取預處理好的 LS300樹脂 120 g濕法裝柱 (2.5 cm×60 cm),緩慢加入濃度為 6.57 mg/mL原花青素水溶液,流速 1BV/h(1BV相當于 1倍層析柱的體積,單位:mL)、溫度 30℃,收集流出液,每管 10 mL,測定其中原花青素的濃度。以流出液體積為 x軸,以流出液原花青素濃度為 y軸,繪制泄露曲線。

圖 9 泄露曲線

從圖 9中可以看出,當流出體積為 70 mL的時候,流出液的原花青素濃度顯著增大,此時原花青素開始泄露,樹脂吸附達到飽和。由泄露曲線計算LS300飽和吸附量為 3.833 mg/g,與 Freundlich等溫吸附方程計算的結果的飽和吸附量 4.585 mg/g相比較低,說明柱中的樹脂還沒有達到飽和吸附,使得動態吸附量偏低。

2.12 動態解吸

取預處理好的 LS300樹脂 250 g濕法裝柱 (2.5 cm×60 cm),緩慢加入 100 mL原花青素濃度為 7.24 mg/mL水溶液,流速 0.5 BV/h,然后加入 3BV的去離子水將未吸附的原花青素及蛋白質、多糖等雜質頂替出去,流速 1BV/h。然后按順序分別加入 2BV乙醇體積分數分別為 20%、40%、60%、80%、100%溶液進行梯度洗脫[9-12],流速為 0.5 BV/h。收集各部分洗脫液,減壓濃縮并冷凍干燥后測定各部分洗脫液中原花青素質量分數 (簡稱質量分數),并計算每部分洗脫液中原花青素的量占總洗脫原花青素量的比例 (簡稱比例)。

表6 不同濃度乙醇濃度溶液梯度洗脫的各組分含量、比率

由表 6可以看出,洗脫出的原花青素主要集中在20%、40%2個組分中,2組分原花青素質量分數分別為 86.5%、92.3%,原花青素純度還不夠高,洗脫條件有待優化。

3 結論

超聲波輔助提取月柿落果原花青素的適宜工藝條件為:超聲波功率 150 W、提取溶劑乙醇體積分數70%、料液比 1∶12、提取時間 15 min、提取溫度 45℃。用此工藝條件提取的月柿原花青素在 LS300大孔吸附樹脂上的吸附行為符合 Freundlich等溫吸附方程。吸附量隨溶液的濃度增大和吸附時溫度的升高而增加,達到吸附平衡的時間約為 5 h。用乙醇水溶液進行梯度洗脫,洗脫下來的原花青素主要集中在 20%、40%2個組分中,其中 20%洗脫組分原花青素含量為86.5%,40%洗脫組分原花青素含量為 92.3%,原花青素純度還不夠高,洗脫條件有待優化。

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Ultrason ic Extraction and Purification of Proanthocyan idins from Persimmon

Li Ren-jie,Chen Jin-ping,Zhang Na,Yan Jing,Wang Heng-chao
(College of Food Engineering and Nutritional Science of ShaanxiNormalUniversity,Xi’an 710062,China)

The opti mum ultrasonic extraction process of proanthocyanidinswas studied.Opti mal extracting condition was confirmed as follows:the rate of powerof ultrasonic was 100%,alcohol contentwas 70%,the ratio of liquid to materialwas1∶12,the extraction timewas15mins and the extraction temperature was45℃.ChooseLS300 resin as the material for the purification.The absorbability ofLS300 resin was studied.The results of static adsorption showed that the adsorption isother m could be correlated with Freundlich.The adsorption equilibrium time was about 5h.The experiment of concentration gradient elution by ethanol solution showed that the most proanthocyanidinswere concentrated on two parts:the 20%and 40%.The mass fractions of two partswere 86.5%and 92.3%.

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碩士研究生 (陳錦屏教授為通訊作者)。

2010-11-19,改回日期:2011-01-08