多菌種發酵丹貝的制作工藝與營養成分分析

劉全德,劉恩岐,賀菊萍,張建萍

(徐州工程學院江蘇省食品生物加工工程技術研究中心,江蘇徐州,221008)

多菌種發酵丹貝的制作工藝與營養成分分析

劉全德,劉恩岐,賀菊萍,張建萍

(徐州工程學院江蘇省食品生物加工工程技術研究中心,江蘇徐州,221008)

以氨基氮含量為主要評價指標,結合感官評分,確定了多菌種發酵制作丹貝的前發酵工藝條件:在蒸煮大豆基質中加入 3%的米粉,接種 3%的乳酸菌,于 42℃發酵 2.5 h至 pH值 5.0,再加入 5%的少孢根霉∶甜酒曲為 3∶2的混合菌,于 37℃下發酵 18 h。將經過前發酵的大豆在鹽水中進行后發酵處理,結果表明,在質量分數為5%的鹽水中于 20℃后發酵 9 d,或在質量分數為 2%的鹽水中于 4℃后發酵 15 d,氨基氮含量等營養成分趨于平衡,發酵丹貝產品的營養和風味明顯改善,通過凍干或油炸等處理,適用于休閑食品、發酵調味料或餐桌菜肴等的開發生產。

大豆,丹貝,少孢根霉,甜酒曲,營養成分

丹貝也叫天培,起源于印度尼西亞,是有益健康的大豆發酵食品[1]。丹貝的制作有天然發酵和純種發酵 2種方法,天然發酵不易控制,易滋生雜菌腐敗[2];純種發酵目前主要以少孢根霉作為丹貝生產的菌種,并添加乳酸酸化,使 pH降低抑制雜菌生長[3-4]。純種發酵丹貝的質量不及天然發酵制品,生產營養和風味較好的丹貝產品不是某一株優良菌種所能提供的,必須有多種微生物的協同作用[5]。吳大康利用我國傳統的甜酒曲制作丹貝的研究表明[6],甜酒曲中的優勢生長菌為米根霉,可以作為丹貝生產的良好菌源。本研究在煮熟大豆中先接種乳酸菌,利用生物發酵產生的乳酸降低大豆基質的 pH值,再同時接種一定比例的少孢根霉和甜酒曲,采用多菌種混合發酵的方法生產營養和風味俱佳的丹貝產品,在發酵工藝條件優化的基礎上[7],通過多菌種發酵與少孢根霉純種發酵丹貝產品營養成分的比較,研究分析了多菌種混合發酵過程中的營養成分變化,旨在為丹貝產品的工藝改進提供理論技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與菌種

大豆,市售;少孢根霉 (Rhizopus oligosporu)和保加利亞乳酸桿菌 (Lactobacillusbulgaricus),中國科學院微生物研究所菌種保藏中心;甜酒曲,江西潤源生物科技公司;培養基,馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA);乙醚 (AR)、乙醇 (AR)、醋酸 (AR),國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

pHS-3C精密 pH計,上海世義精密儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器、電熱恒溫培養箱,上海躍進醫療器械廠;TU-1810紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;LGJ-18A型冷凍干燥機,北京四環科學儀器廠有限公司。

1.2 方法

1.2.1 丹貝發酵制作工藝

1.2.1.1 發酵菌種的制備

少孢根霉孢子粉的制備[8]:將少孢根霉菌種接種到 PDA培養基上,37℃恒溫培養 24 h,至表面長滿白色孢子為止。用無菌水制成孢子懸浮液,然后和滅菌米粉混合,冷凍干燥,制成少孢根霉孢子粉,裝入無菌平皿中,在 0～4℃保存備用。

乳酸菌的制備:將已活化的菌種以 3%接菌量接入經 115℃、0.1 MPa滅菌的牛奶培養基中,于 42℃恒溫培養至乳凝固,放入 0～4℃冰箱中備用。

甜酒曲的使用:將商品甜酒曲保存在 0～4℃冰箱中,直接接種使用。

1.2.1.2 單菌種發酵試驗

大豆浸泡去皮后常壓蒸煮 30 min,攤放在清潔的白磁盤上,冷卻至 30℃左右,用乳酸調節 pH值,在大豆基質中分別接入不同比例的少孢根霉孢子粉、乳酸菌或甜酒曲,覆蓋一層保鮮膜,分別于 27～47℃不同溫度條件下發酵 6～18 h,根據發酵產品中的氨基氮含量,結合感官評價確定少孢根霉、乳酸菌和甜酒曲發酵的最適溫度、最適 pH值、最佳接種量和最佳發酵時間。在試驗得出的最適發酵條件下,分析比較少孢根霉、乳酸菌和甜酒曲對蒸煮大豆的發酵作用。

1.2.1.3 多菌種發酵試驗

前酵工藝的確定:將乳酸菌接種于蒸煮大豆中,將大豆基質的 pH降至少孢根霉和甜酒曲發酵的最適條件;再將少孢根霉和甜酒曲按不同的比例,接種于大豆基質中進行多菌種混合發酵,以發酵大豆的氨基氮含量為評價指標,結合感官評定分析確定少孢根霉與甜酒曲的最佳混合比例;采用正交試驗設計進一步確定少孢根霉與甜酒曲混合發酵的接種量、發酵時間和發酵溫度等前酵最佳工藝條件。

后酵工藝的確定:將前發酵后的大豆按大豆基質的質量:鹽水量為 1∶1.5分別浸入質量分數為 1%、2%和 3%的 4℃鹽水中,或質量分數為 2%、5%和8%的 20℃鹽水中,進行發酵成熟,每隔 3天測一次氨基氮含量等,結合感官評定綜合分析確定后酵工藝條件。

1.2.1.4 丹貝發酵產品感官評價

以 10人組成感官評定小組,按色澤、外形、組織狀態和風味等指標評分,具體項目和評分標準見表1。

表1 丹貝發酵產品感官評價標準

1.2.2 丹貝發酵產品營養成分的測定

1.2.2.1 含氮營養成分的測定[8-9]

總氮量的測定:將丹貝發酵樣品凍干磨碎后,以凱氏定氮法測定總氮。

酸溶性氮 (游離氨基酸及肽類物質)含量的測定:將丹貝樣品凍干磨碎,以質量分數為 10%的醋酸水溶液浸泡,沸水浴 1 0 min提取含氮物,4 000 r/min離心 3 0 min,取上清液;余下的沉淀再重復提取 2 次,合并上清液,以凱氏定氮法測定酸溶性氮。

氨基酸態氮含量的測定:甲醛滴定法。

多肽氮的推算:多肽氮 =酸溶性氮 -氨基酸態氮

水溶性氮的測定:以蒸餾水代替 1 0%醋酸 2 0℃浸泡樣品 1 0 min,其余步驟同酸溶性氮含量的測定。

醇溶性氮含量的測定:以 70%乙醇代替 10%醋酸浸泡樣品,提取條件為 6 0℃水浴 1 0 min,其余步驟同酸溶性氮含量的測定。

1.2.2.2 脂類營養成分的測定[10-11]

脂類總量的測定:索氏抽提法。

碘價的測定:取索氏抽提所得脂肪測定碘價。

1.2.2.3 還原糖含量的測定

稱取冷凍干燥樣品 1.0 g于 100 mL容量瓶中,加水 8 0 mL,在 4 5℃水浴中加熱 1 h,并持續振蕩。冷卻后定容,混勻。放置 3 0 min,離心后取上清液,采用亞鐵氰化鉀法測定還原糖含量[10]。

1.2.2.4 總酸含量的測定

稱取 1 0 g凍干磨碎樣品,加 60 mL水于沸水浴中保溫攪拌 1 h,再轉移到 100 mL容量瓶中定容,3 500 r/min離心 2 0 min,取 10.0 mL上清液用 0.1 mol/L NaOH滴定[10]。

2 結果與分析

2.1 丹貝發酵制作工藝試驗結果分析

2.1.1 單菌種發酵制作丹貝試驗結果

少孢根霉、乳酸菌和甜酒曲的最適發酵條件與丹貝發酵試驗結果見表 2。經少孢根霉發酵的大豆氨基氮含量較高,甜酒曲次之,且發酵豆瓣表面均能形成致密的白色菌絲、感官評分良好,說明少孢根霉和甜酒曲具有較強的蛋白水解酶系,均可單獨作為丹貝制作的發酵菌種。而乳酸菌僅有輕微的蛋白水解能力,不能單獨作為丹貝制作的發酵菌種。

表2 單菌種發酵制作丹貝試驗結果比較

2.1.2 多菌種最佳發酵條件的確定與丹貝發酵試驗結果

2.1.2.1 乳酸菌發酵時間的確定

本試驗將乳酸菌作為生物降酸的菌種,當接種3%乳酸菌發酵至 2.5 h時,大豆蒸煮基質的 pH由pH值 6.3降至 pH值 5.0,為少孢根霉和甜酒曲的適宜 pH,因此確定乳酸菌發酵時間為 2.5 h。

2.1.2.2 少孢根霉和甜酒曲混合發酵接種比例的確定

大豆基質經乳酸菌發酵降酸后,加入少孢根霉和甜酒曲混合發酵 18 h制作丹貝產品,少孢根霉和甜酒曲接種比例的試驗結果如表 3。當少孢根霉和甜酒曲按 3∶2接種時,氨基氮含量、NSI和感官評分最高,而接種比例增加為 4∶1時,大豆表面菌絲有部分變黑,感官欠佳,因此確定少孢根霉和甜酒曲按 3∶2接種。

表3 少孢根霉和甜酒曲混合發酵接種比例的試驗結果

2.1.2.3 多菌種發酵制作丹貝前酵工藝條件試驗結果

選擇混合菌 (少孢根霉∶甜酒曲為 3∶2)接種量、發酵溫度、發酵時間和米粉添加量為影響因素,選用L9(34)正交表進行試驗,試驗結果見表 4。

表4 多菌種發酵制作丹貝正交試驗結果

由表 4極差分析可知,各因素對丹貝氨基氮含量的影響次序為:A>B>C>D,即接種量 >發酵溫度 >發酵時間 >米粉添加量,丹貝前酵最佳工藝條件為A2B2C2D3。對理論分析最佳發酵工藝條件做驗證試驗,結果表明,在該工藝條件下發酵大豆氨基氮含量為 0.35%,高于試驗最佳組合 5發酵大豆 0.32%的氨基氮含量,且產品質地風味俱佳,感官評分值達95分。據此確定了多菌種發酵制作丹貝前酵最佳工藝條件:在蒸煮大豆基質中加入 3%的米粉,米粉的作用主要是吸收豆瓣表面過多的水分,并可作為微生物生長的碳源,先接種 3%的乳酸菌,于 42℃恒溫發酵 2.5 h至 pH5.0,然后接種 5%的少孢根霉和甜酒曲混合菌 (少孢根霉∶甜酒曲為 3∶2),在 37℃恒溫下發酵 18 h。

2.1.2.4 多菌種發酵制作丹貝后酵工藝條件試驗結果

將前發酵后的大豆按大豆基質總質量∶鹽水量為1∶1.5進行后發酵處理,利用前酵過程中積累的蛋白酶和脂肪酶繼續分解大豆蛋白與脂肪,增進發酵大豆的營養價值與風味。結果表明,在質量分數為 5%的鹽水中于 20℃后發酵 9 d或在質量分數為 2%的鹽水中于 4℃后發酵 15 d,氨基氮含量及 NSI等指標趨于平衡,發酵制品的營養和風味明顯提高。

2.2 丹貝發酵產品營養成分測定結果分析

2.2.1 含氮營養成分的測定結果比較

不同發酵處理丹貝產品氮素營養成分的比較見表 5。前酵豆與蒸煮豆的總氮含量無明顯變化,后酵豆總氮明顯減少,可能是氨態氮經過硝化細菌的氧化作用,導致系統內氨減少所致[12]。多菌種前酵豆酸溶性氮(游離氨基酸及肽類物質)、氨基氮等的含量均明顯高于少孢根霉單菌種發酵豆,表明多菌種發酵的蛋白酶系種類較多,可以彌補少孢根霉單菌發酵酶系單一之不足,多菌種混合發酵較單一菌種發酵丹貝產品的營養價值高。后酵豆的酸溶性氮、氨基氮等的含量均顯著高于多菌種前酵豆,表明后酵過程利用前酵中積累的蛋白酶繼續分解大豆蛋白,是丹貝營養及風味物質形成的重要時期。

表5 不同發酵處理丹貝產品氮素營養成分的比較

2.2.2 脂類營養成分的測定結果比較

不同發酵處理丹貝產品脂類營養成分的比較見表 6。前酵豆和后酵豆的總脂含量與蒸煮豆對照相比均有所降低,可能是脂肪被作為菌種生長所需的碳源所致[12]。多菌種前酵過程中不僅少孢根霉有分解脂肪的能力,而且甜酒曲中的絲孢酵母和米曲霉也有分解脂肪的能力,多菌種前酵豆比少孢根霉發酵豆的總脂含量的降低程度大。碘價體現了脂肪的不飽和程度,少孢根霉發酵豆、多菌種前酵和后酵豆的碘價依次升高,表明丹貝產品中脂肪的不飽和程度在脂肪酶的作用下不斷提高,不飽和脂肪酸具有降低膽固醇、防止動脈硬化等生理功能,意味著其保健作用隨之加強。

表6 不同發酵處理丹貝產品脂類營養成分的比較

2.2.3 還原糖與總酸含量的測定結果比較

不同發酵處理丹貝產品的還原糖與總酸含量比較見表 7。少孢根霉發酵豆還原糖含量增加不明顯,多菌種前酵豆的還原糖含量與蒸煮豆對照相比顯著增加,這是因為少孢根霉不能利用淀粉,對水蘇糖、棉子糖、蔗糖的利用率也很差,因此生成的還原糖較少,而多菌種發酵甜酒曲中的米根霉可使淀粉轉化為葡萄糖,還原糖含量增加較多。后酵豆的還原糖含量顯著降低,比蒸煮豆對照還低,這是因為在發酵過程中,微生物會利用分解碳水化合物得到的還原糖滿足自身有機體的合成與能量的需要,到發酵后期還原糖生成量遠低于還原糖消耗量,因此表現為還原糖含量的減少[12]。

表7 不同發酵處理丹貝產品還原糖和總酸含量的比較

多菌種前酵豆和少孢根霉發酵豆的總酸含量與蒸煮豆對照相比明顯增加,說明在發酵過程中微生物分泌大量的淀粉酶和脂肪酶,使大豆中的碳水化合物和脂肪分解成有機酸和脂肪酸,使總酸含量增加。后酵豆中的總酸含量顯著高于多菌種前酵豆和少孢根霉發酵豆,表明并印證了后酵是丹貝中總酸及其他風味物質形成的重要時期[12]。

3 結論

試驗確定了乳酸菌、少孢根霉和甜酒曲多菌種發酵制作丹貝產品的新工藝,乳酸菌發酵起到了生物降酸作用,為后續少孢根霉和甜酒曲混合菌種發酵創造了適宜 pH條件,且乳酸菌利用可發酵性糖產生乳酸有助于改善產品的風味。多菌種發酵的酶系種類較多,可以彌補少孢根霉單菌發酵酶系單一之不足。多菌種發酵丹貝的酸溶性氮 (游離氨基酸及肽類物質)、氨基氮等含氮營養成分以及不飽和脂肪酸、還原糖與總酸等的含量均高于少孢根霉單菌種發酵產品,多菌種混合發酵丹貝的營養價值和感官品質較少孢根霉單菌純種發酵明顯提高。

在多菌種發酵的基礎上探討了丹貝的后發酵成熟過程,結果表明后發酵過程利用前酵中積累的蛋白酶和脂肪酶繼續分解大豆蛋白與脂肪等,是營養物質以及風味物質形成的重要時期。在質量分數為 5%的鹽水中于 20℃后酵 9d的產品,具有濃郁的醬香與酯香味,但其含鹽量高,可以作為發酵調味料或凍干磨粉后與其他調味品混合制成復合調味劑。在質量分數為 2%的鹽水中于 4℃后酵 15d的產品,含鹽量較低,風味柔和,經凍干或油炸處理等可以加工為休閑食品或餐桌菜肴。

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Manufacture Technology and Analysis of Nutritional Compositions of Tempe Fermented byM ultiple-stra in Culture

Liu Quan-de,Liu En-qi,He Ju-ping,Zhang Jian-ping
(Jiangsu Engineering Research Center for Food Biology Processing,Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221008,China)

This study took the content of amino nitrogen as evaluation indicator,combined sensory scoring,and determined the opti mum technology of primary fermentation following these steps:added 3%rice flour in cooked soybean,inoculated 3%lactic acid bacteria,fer mented for 2.5 hours at 42℃(pH 5.0),then fermented further for 18h at 37℃with additional 5%mix-culture of rhizopus oligosporus and s weetwine koji(ratio of 3∶2).The results showed that the contentsof amino nitrogen were al most the same as the former fermented soybean fermented in 5%saline at 20℃ for9 days,2%saline at4℃ for 15 days afterpost-fer mentationmaturing.Nutritional facts and flavorof tempe were both improved after fer mentation.By freeze-drying or frying,tempe can be developed as snack food,fermented seasoning and table food.

soybean,tempe,rhizopus oligosporu,s weetwine koji,nutrition matter

學士,副教授 (劉恩岐教授為通訊作者)。

2010-10-19,改回日期:2010-12-20