高速逆流色譜分離制備白胡椒中單萜類化合物＊

蔣志國,陳文學,劉四新

(海南大學食品學院,海南海口,570228)

高速逆流色譜分離制備白胡椒中單萜類化合物＊

蔣志國,陳文學,劉四新

(海南大學食品學院,海南海口,570228)

應用高速逆流色譜法分離制備了白胡椒中 3種單萜類化合物。以 V(叔丁基甲基醚)∶V(甲醇)∶V(水)=2∶1∶1為兩相溶劑系統,上相為固定相,下相為流動相,在主機轉速 900 r/min、流動相流速 2.5 mL/min條件下,從 2.76 g樣品中一步分離制備得到 3,7-二甲基-2-辛烯-1,6,7-三醇 35 mg,對薄荷烷-1,2,8-三醇-2-O-β-D葡萄糖苷 55mg,5-羥基龍腦-2-O-β-D葡萄糖苷 40mg,經高效液相蒸發光散射檢測器 (HPLC-ELSD)檢測純度均達95.0%以上,各化合物結構經質譜和核磁共振氫譜、碳譜鑒定。研究結果表明,利用該方法可以對白胡椒中的單萜類化合物進行快速的分離和純化,且制備量大,分離效率高。

白胡椒,高速逆流色譜,單萜

白胡椒 (Piper nigrumL.)為胡椒科植物胡椒的干燥成熟果實,又名白川。白胡椒是一種經濟價值很高的熱帶香辛作物,是藥食兩用產品,也是世界著名的調味料。胡椒中含有多種化學成分,如胡椒堿、氮苯烷、松節油萜、水茴香萜、檸檬萜等[1]。研究表明,萜類化合物具有抗病毒、細菌、真菌,抗腫瘤,預防心血管疾病以及松弛平滑肌等多種生物活性[2]。萜類化合物的分離制備一般采用有機溶劑提取,再經過反復重結晶或硅膠柱層析純化,可獲得高純度的產物[3-4]。由于多次重結晶以及硅膠柱層析會對目標產物造成較大的損失,使得收率大大降低,同時其過程繁瑣冗長。

高速逆流色譜 (high-speed countercurrent chromatography,HSCCC)技術是一種無固體載體的連續液-液分配色譜技術,其固定相通過重力場和離心力場作用被保留在分離柱內,避免了固體載體與樣品發生化學反應而變性及不可逆吸附,樣品回收率高,可從粗制樣品中在規模制備高純度單體化合物,已廣泛用于生化工程、醫藥、天然產物、食品等領域[6-9]。

本文以白胡椒為原料,運用制備型高速逆流色譜對白胡椒中的單萜類化合物進行了制備、純化及結構鑒定。

1 實驗材料與設備

1.1 實驗材料

白胡椒 (市售),反相精細分離填料 MCI-GEL CHP20P(北京綠百草科技發展有限公司);20 cm×20 cm Sillca gel 60 F254薄層層析色譜板 (Merck德國);石油醚,甲醇,乙酸乙酯,叔丁基甲基醚 (分析純試劑),華東醫藥股份有限公司;色譜純甲醇 (Merck德國)。

1.2 主要儀器設備

HSCCC-D1200制備型高速逆流色譜儀 (浙江工商大學逆流色譜研究室),包括 K-1800 Wellchrom恒流泵 (Knauer德國)、B-684自動收集器 (Büchi,瑞士)和Model 8823A-UV紫外檢測器 (北京新技術應用研究所),聚四氟乙烯管纏繞在 5個水平軸上形成螺旋管 (5 mm I.D.柱容積 1 200 mL),轉速 0～1 000 r/min;玻璃色譜柱,Φ5 cm ×50 cm(杭州常盛科教器具廠);N-1000旋轉蒸發儀 (上海愛朗儀器有限公司);FD-1冷凍干燥機 (北京博醫康技術公司);LC-20A高效液相色譜儀 (Shimadzu,Japan),包括SEDEX75蒸發光散射檢測器 (Sedex公司 法國);質譜采用 Bruker Esquire 3000 plus質譜儀 (Bruker美國)進行測定,離子源為 ESI;AVANCE DMX 500核磁共振儀 (Bruker德國)。

2 實驗方法

2.1 樣品的預處理

稱取胡椒粉 5 kg用體積分數 95%乙醇于 50℃浸提 3次,每次乙醇用量 50 L,浸提 24 h,并不斷攪拌。將 3次得到的浸提液混合,于 45℃下減壓濃縮至無醇味后,將濃縮物分散于 5 L蒸餾水中,依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取 3次,萃取液減壓濃縮后得正丁醇相粗提物 40 g。

2.2 正丁醇相粗提物分離

將 500 gMCI-GEL CHP20P填料裝入半徑為 2.5 cm,長為 50 cm的玻璃柱中,依次用蒸餾水、甲醇、蒸餾水各沖洗不少于 3倍柱體積,平衡 24h后上樣。

正丁醇相提取物 40 g先用少量甲醇溶解,然后加入適量已處理好的MCI-GEL CHP20P填料,混合拌樣,減壓濃縮至干并上樣。依次用蒸餾水、30%甲醇、60%甲醇、和 90%甲醇洗脫,每次 3個柱體積,洗脫至流出液沒有顏色,旋轉蒸發,冷凍干燥后得 60%甲醇洗脫部分 (Fr60)2.76 g,待用。

2.3 HSCCC分離

本實驗所用溶劑系統為叔丁基甲基醚-甲醇-水(體積比 =2∶1∶1),4種溶劑按比例置于分液漏斗中,充分振蕩后靜置分層。上相作為固定相,下相作為流動相,超聲脫氣后備用。稱取 2.5 g樣品,用上下相各 40 mL溶解,超聲脫氣后備用。將固定相注滿HSCCC-D1200螺旋管后開啟直流電機,轉速調至 900 r/min,并以 2.5 mL/min的流量從首端泵入流動相,在色譜柱尾端用量筒接收流出的固定相;待色譜柱尾端不再有固定相流出時,表明系統已動態平衡,量出流出的固定相體積,計算在此條件下的固定相保留率S,即 S=(V柱-V出)/V柱,式中 V柱為柱體積 (mL),V出為流動相推出的固定相體積 (mL);進樣 80 mL,以 20 mL試管收集流出液,共收集 136管,并采用TLC點樣檢測分離情況。展開劑為三氯甲烷-甲醇-水 (體積比 65∶35∶10)靜置后的下層溶液,顯色劑為10%硫酸 -乙醇 (體積比 10∶90)溶液。

2.4 高效液相蒸發光散射(HPLC-ELSD)分析條件

色譜柱:Waters Symmetry Cl8色譜柱 (4.6 mm×150 mm,5μm);流動相 V(CH3CN)∶V(H2O)=(60∶40);流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量:10μL;ELSD檢測器參數:漂移管溫度 70℃,ELSD的增益值為 7,載氣為空氣,壓力 0.35 MPa。

3 結果與分析

3.1 溶劑體系選擇

一個穩定的兩相溶劑體系是否適合于目標物質的分離,通常要看物質在該溶劑體系中的分配系數是否在一個合適的范圍內。分配系數 K=cS/cM,其中cS指溶質在固定相中的濃度,cM指溶質在流動相中的濃度。一般而言,對 HSCCC最合適的 K值范圍是0.5～2。當 K值≤0.5時,出峰時間太快,峰之間的分離度較差;當 K值≥2時,出峰時間太長,且峰形變寬。而在 0.5≤K≤2時,可以在合適的時間內,得到分離度較好的峰形。

溶劑系統的選擇是逆流色譜分離中的首要環節,為了檢查溶劑系統的適用性,需要對分配系數進行測定。測定方法包括高效液相色譜分析型逆流色譜和 TLC法等。TLC法的準確度較低,但方便、快速。選擇溶劑系統的目的是分離樣品,測定分配系數只是為了檢查溶劑系統的適用性,對其準確度要求不高,因此 TLC法對各種樣品,尤其是復雜天然產物分離的逆流色譜溶劑系統選擇非常適用。在工作中發現,根據斑點色度可以觀察樣品中各組分的相對含量及其在兩相溶劑中的分配情況,即估計分配系數的大小及差異,由此可以確定溶劑系統的適用性及各組分的流出順序。

依據經驗,按照溶劑系統選擇的原則和過程,在實驗過程中進行了大量的篩選,得到以下 2種溶劑系統。

(A)V(三氯甲烷 )∶V(甲醇 )∶V(水 )=5∶4∶3

(B)V(叔丁基甲基醚 ) ∶V(甲醇 ) ∶V(水 )=2∶1∶1

各溶劑系統的的 TLC分析結果如圖 1所示。

圖 1 胡椒 60%甲醇洗脫部分在 2種溶劑系統中上下相的薄層色譜圖

從圖 1中可以看出,在溶劑系統 A中,樣品中各組分主要集中在下相,上相很少或無,分配系數很不合理,不適合作為逆流色譜分離中的溶劑系統。在溶劑系統B中,樣品中各組分在上下相中都有較好的分配,而且從斑點色度來看,系統 B中各組分之間的分配系數差異較為明顯,且分層時間較短為 30 s。因此,最后選定選擇溶劑系統 B作為高速逆流色譜分離的溶劑體系。

3.2 HSCCC-D1200分離參數的優化

3.2.1 流速對 HSCCC保留率的影響

流動相的流速不但顯著影響分離時間,而且也會對分離度產生一的影響。以叔丁基甲基醚-甲醇-水為兩相溶劑系統,上相為固定相,下相為流動相,在其它參數相同的條件下,流速越大,分離時間越短,但是固定相保留率越小,分離度就越小。因此,要在保證固定相保留率和分離度的前提下盡可能縮短分離時間。因此,綜合實際分離情況,本試驗最佳流速選為2.5mL/min。

圖 2 不同流速對 HSCCC-D1200固定相保留率的影響

3.2.2 轉速對 HSCCC保留率的影響

以叔丁基甲基醚-甲醇-水為兩相溶劑系統,上相為固定相,下相為流動相,流動相的流速為 2.5mL/min時高速逆流色譜儀轉速的變化對固定相保留率的影響情況如圖 3所示。研究表明,螺旋柱的旋轉速度對兩相溶劑系統在流體動力學平衡時的體積比影響很大,轉速越大,固定相的保留值越大。一般來說,保留率越高對分離越有利,但考慮到儀器承受能力有限,另外轉速過高,還容易造成乳化,因此,本試驗最佳轉速選為 900 r/min。

圖 3 不同轉速對 HSCCC-D1200固定相保留率的影響

3.3 HSCCC-D1200分離胡椒 60%甲醇洗脫部分結果

以上相為固定相,下相為流動相。溶劑系統為3.1中 (B),進樣量 2.5 g,進樣時流動相流速為 1.0 mL/min,進樣后流動相流速為 2.5 mL/min,轉速 900 r/min,收集 7 min/tube(20 mL試管),固定相保留率55%。TLC結果如圖 4所示。

圖 4 HSCCC-D1200分離胡椒 60%甲醇洗脫部分的薄層色譜圖

根據 TLC結果可知,合并 12～26管,46～80管,102～126管,旋轉蒸發和冷凍干燥,稱量后分別得化合物 1(35 mg)、化合物 2(55 mg)和化合物 3(40 mg)。

3.4 純度鑒定

用 HPLC-ELSD對分離制備得到的單體化合物1、2和 3進行純度鑒定 (見圖 5)。結果表明,3種化合物純度分別達到了 95.8%、96.1%和 96.3%(面積歸一法),具備了進行進一步的結構解析的要求。

3.5 結構解析

化合物 1 ESI-MS(m/z)∶211[M +Na]+.1H NMR(δin CD3OD):1.17(3H,s,H-8),1.20(3H,s,H-9),1.40(1H,m,H-5a),1.75(1H,m,H-5b),1.69(3H,s,H-10),2.07(1H,m,H-4a),2.29(1H,m,H-4b),3.25(1H,d,J=10.5Hz,H-6),4.10(1H,d,J=6.5 Hz,H-1),5.42(1H,m,H-2);13C NMR(δin CD3OD):14.9(C-10),23.4(C-8),24.4(C-9),29.1(C-5),36.4(C-4),58.1(C-1),72.3(C-7),77.5(C-6),123.6(C-2),138.3(C-3)。對照文獻[9],判斷該化合物為 (R)-3,7-dimethyloct-2E-en-1,6,7-triol,即 3,7-二 甲 基 -2-辛烯 -1,6,7-三醇。

化合物 2 ESI-MS(m/z):373[M +Na]+.1H NMR(δin CD3OD):3.89(1H,m,H-2),2.52(1H,m,H-3a),1.68(1H,dt,J=17.4,2.7 Hz,H-3b),1.52(1H,m,H-4),1.98(1H,m,H-5a),1.61(1H,m,H-5b),1.11(3H,s,H-7),1.20(3H,s,H-9),1.28(3H,s,H-10),4.34(1H,d,J=8.2 Hz,H-1 ’),3.15(1H,d,J=8.4 Hz,H-2 ’),3.38(1H,m,H-3 ’),3.36(1H,m,H-4 ’),3.26(1H,m,H-5 ’),3.87(1H,d,J=11.4 Hz,H-6 ’a),3.73(1H,dd,J=10.4,4.9 Hz,H-6’b);13C NMR（δi nC D3OD):73.5(C-1),76.4(C-2),34.6(C-3),35.3(C-4),23.0(C-5),26.8(C-6),25.0(C-7),75.3(C-8),29.4(C-9),29.1(C-10),106.2(C-1 ’),74.9(C-2 ’),78.1(C-3 ’),71.7(C-4’),77.6(C-5’),62.9(C-6’)。對照文獻[10],判斷該化合物為 p-menthane-1,2,8-triol-2-o-β-D-glucopyranoside,即對薄荷烷-1,2,8-三醇-2-O-(-D葡萄糖苷。

化合物 3 ESI-MS(m/z):355[M+Na]+.1H NMR(δin CD3OD):3.83(1H,m,H-2),1.10(1H,m,H-3a),2.26(1H,m,H-3b),1.66(1H,d,J=4.5 Hz,H-4),3.82(1H,m,H-5),1.33(1H,m,H-6a),2.50(1H,m,H-6b),0.86(3H,s,H-8),1.07(3H,s,H-9),0.97(3H,s,H-10),4.25(1H,d,J=7.5 Hz,H-1’),3.18(1H,m,H-2’),3.31(1H,m,H-3 ’),3.28(1H,m,H-4 ’),3.23(1H,m,H-5 ’),3.66(1H,m,H-6 ’a),3.84(1H,m,H-6 ’b);13C NMR(δ in CD3OD):50.1(C-1),84.6(C-2),34.6(C-3),52.3(C-4),76.7(C-5),70.2(C-6),46.8(C-7),18.9(C-8),19.9(C-9),12.3(C-10),104.5(C-1 ’),74.0(C-2 ’),76.7(C-3’),70.2(C-4’),76.4(C-5’),61.4(C-6’)。對照文獻[11],判斷該化合物為 5-hydroxy bornyl-2-O-β-D-glucopyranoside,即 5-羥基龍腦-2-O-β-D葡萄糖苷。

圖 5 HSCCC分離得到的單萜化合物的HPLC-ELSD色譜圖

4 結論

本次研究工作采用了制備型高速逆流色譜儀對熱帶香辛料白胡椒中的活性單萜類化合物進行了分離純化。實驗過程中系統地優化了溶劑體系和實驗參數,在適宜的分離條件下,即 V(叔丁基甲基醚)∶V(甲醇 )∶V(水 )=2 ∶1∶1,為兩相溶劑系統 ,上相為固定相,下相為流動相,主機轉速 900 r/min,流動相流速 2.5 mL/min,通過一步分離得到了 3,7-二甲基-2-辛烯-1,6,7-三醇 (35 mg,95.8%)、對薄荷烷-1,2,8-三醇-2-O-β-D葡萄糖苷 (55 mg,96.1%),5-羥基龍腦-2-O-β-D葡萄糖苷 (40 mg,96.3%)。相比于傳統的分離方法如硅膠柱色譜,高速逆流色譜具備一系列的獨特優勢如很高的樣品回收率、較大的樣品進樣量、較低的溶劑消耗等,非常適用于分離制備天然植物中的生物活性成分。

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Study on the Separation ofM onoterpenes fromPiper nigrum L.by High-speed Counter-current Chromatography

Jiang Zhi-guo,ChenWen-xue,Liu Si-xin
(College of Food Science,Hainan University,Haikou 570228,China)

Three monoterpeneswere prepared,isolated and purified fromPiper nigrumL..by high-speed counter-current chromatography(HSCCC).A two-phase solvent system composed of TBME-methanol-water(2∶1∶1,v/v/v)was used.The upper phase was stationary phase and lower phase was mobile phase.By one-step elution,under the conditions of a flow rate of 2.5 mL/min and 900 r/min,35 mg of 3,7-dimethyloct-2E-en-1,6,7-triol,55 mg of p-menthane-1,2,8-triol-2-O-β-D-glucopyranoside and 40 mg of 5-hydroxy bornyl-2-O-β-D-glucopyranoside was obtained from 2.76 mg of the butanol extract ofPiper nigrumL.,the puritieswas over 95.0%detected by high perfor mance liquid chromatographywith evaporative light scattering detection.The obtained fractions were analyzed by high performance liquid chromatography(HPLC),and identified bymass spectrometry(MS),1H-nuclearmagnetic resonance(NMR)and13C-NMR.The results indicated that HSCCC is a powerful technique for the purification ofmonoterpenes fromPiper nigrumL.with high productive capacity and high efficiency.

Piper nigrumL.,high-speed counter-current chromatography,monoterpene

博士,講師 (陳文學為通訊作者)。

＊海南省自然科學基金資助 (808102)和海南大學校基金(hd09xm90)資助

2010-09-15,改回日期:2011-01-12