酶法水解麥冬多糖及其產(chǎn)物的分離鑒定＊

呂寧,金鳳燮,魚紅閃

麥冬為百合科沿階草屬植物麥冬(Ophiopogon japonicusKer-Gawl)的干燥塊根[1],具有滋陰生津、潤(rùn)肺止咳等功效。麥冬多糖為其主要活性成分之一,具有多種藥效功能,主要集中在抗心肌缺血[2]、抗血栓形成[3]、耐缺氧[4]、降血糖[5]等方面。多糖的活性與其相對(duì)分子質(zhì)量大小、單糖組成及分子結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系,且免疫應(yīng)答主要由相對(duì)分子質(zhì)量大小而決定[6]。研究發(fā)現(xiàn),相對(duì)分子質(zhì)量 1萬(wàn)以下的麥冬多糖有較為顯著的抗心肌缺血作用[7]。

目前有關(guān)麥冬多糖的化學(xué)、藥理與臨床研究已經(jīng)十分令人矚目,但是有關(guān)酶法水解麥冬多糖的深入具體研究報(bào)道尚不多見(jiàn)。由于酶具有特異性,可選擇性地酶解切斷特定糖苷鍵,從而對(duì)麥冬多糖進(jìn)行專一降解,制得特定聚合度的產(chǎn)物。本研究采用生物酶法水解麥冬多糖,對(duì)其產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量及單糖組成進(jìn)行研究,以期為麥冬多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥冬,市售,浙江慈溪產(chǎn);菌種Absidiasp.O8s,由大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院菌種保藏所提供;單糖標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma公司;Sephadex G-100、Sephadex G-50,Phar macia公司;薄層層析版,德國(guó) Merck公司;藍(lán)色葡聚糖及標(biāo)準(zhǔn)系列葡聚糖,Pharmacia公司;乙腈(色譜純),大連科密歐試劑公司;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;BSZ-100自動(dòng)部分收集器,上海滬西生化儀器廠;GL-21M高速冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;YQX-LS-SⅡ全自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;JASCO LC-2000系列高效液相色譜,日本分光公司;Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,美國(guó) Alltech公司。

1.3 方法

1.3.1 麥冬多糖的制備

多糖提取:100 g麥冬經(jīng)粉碎后,加去離子水煎煮3次,每次加 10倍量水,每次煮沸 30 min。紗布過(guò)濾,合并濾液并減壓濃縮至 1 mg/mL,乙醇沉淀至醇體積分?jǐn)?shù)為 80%,靜止過(guò)夜,濾去上清液,沉淀冷凍干燥即得到麥冬粗多糖。

分離純化:取 2 g麥冬粗多糖,用 Sevage法除去蛋白,然后經(jīng) Sephadex G-100進(jìn)行凝膠柱層析 (16 mm×800 mm),用去離子水洗脫,控制流速 0.5 mL/min,10 min一管分部收集,苯酚-硫酸法檢測(cè),合并峰位,冷凍干燥,得純麥冬多糖。

1.3.2 純度鑒定

凝膠柱層析:用 Sephadex G-100柱層析,去離子水洗脫,苯酚-硫酸法檢測(cè);光譜掃描:采用紫外光譜在 180～340 nm波長(zhǎng)間掃描;薄層層析:展開(kāi)劑為V(正丁醇):V(乙醇):V(水)=4∶1∶1,苯酚硫酸顯色。

1.3.3 麥冬多糖的酶法水解

1.3.3.1 菌種的發(fā)酵及粗酶液制備[8]

液體培養(yǎng)基:取 10 g麥冬,粉碎后加去離子水100 mL,煮沸 1h,紗布過(guò)濾,反復(fù)提取 3次,減壓蒸餾并定容至 100 mL。取 80 mL,5°麥芽汁和 20 mL麥冬粉末浸出液混勻制備培養(yǎng)基。

菌種發(fā)酵:取活化好的菌種斜面,用接種針在液體培養(yǎng)液中接菌 2～3環(huán),置 30℃恒溫培養(yǎng)箱中搖床振蕩培養(yǎng) 6 d。

粗酶液制備:培養(yǎng)好的發(fā)酵液,用高速冷凍離心機(jī)在 4℃、8 000 r/min下離心 15 min,收集上清液。上清液在磁力攪拌條件下加入硫酸銨粉末調(diào)飽和度至 75%,放入 4℃冰箱靜置 12 h。然后在 4℃、13 000 r/min下離心 20 min,取沉淀。將沉淀用 10 mL 0.02 mol/L、pH5.0的 HAc-NaAc緩沖液溶解,放入透析袋中,用同一緩沖液透析,每 4 h更換 1次緩沖液,透析 24 h。透析結(jié)束后,取出液體在 4℃、13 000 r/min下離心 10 min,取上清液,此即粗酶液。

1.3.3.2 麥冬多糖與生物酶反應(yīng)

取 0.5 g純麥冬多糖,用少量 0.02 mol/L、pH值5.0的 HAc-NaAc緩沖液充分溶解,定容到 50 mL,配制成質(zhì)量濃度為 10 g/L的純麥冬多糖溶液。與等體積的上述 1.3.3.1中制備的粗酶液混勻,在 40℃下反應(yīng) 10 h。反應(yīng)結(jié)束后,用 Sephadex G-100柱對(duì)酶解后產(chǎn)物進(jìn)行分離。

1.3.4 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定[9]

采用 Sephadex G-100和 Sephadex G-50柱層析法。用 DextranT-70、T-40、T-10和相對(duì)分子質(zhì)量為7100的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品,分別相繼上 Sephadex G-100柱,分布收集,苯酚-硫酸法檢測(cè),做出洗脫曲線,求得洗脫體積Ve,然后將藍(lán)色葡聚糖上同一根柱,求得柱的空體積Vo,最后做出Ve/Vo與相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為Y=-0.305 1X+5.546 3,R2=0.996 2(Y代表 lgMr,X代表Ve/Vo)。用相對(duì)分子質(zhì)量分別為 7 100,4 600,2 500和 1 085的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品,分別相繼上 Sephadex G-50柱,方法同 Sephadex G-100柱,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為Y=-0.337 1X+5.269 5,R2=0.992 9。純麥冬多糖及其酶解產(chǎn)物按同樣條件上柱,即可測(cè)算出樣品中每一組分多糖的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.5 單糖組成的分析[10]

取純麥冬多糖及其酶解產(chǎn)物各 20 mg,分別加入2 mL 2 mol/L H2SO4溶液,100℃密封水解 12 h。反應(yīng)結(jié)束后用 BaCO3中和,離心,取上清液,微孔濾膜過(guò)濾,取 20μL用于色譜分析。與標(biāo)準(zhǔn)單糖的 HPLC圖譜比較,確定單糖組分。

色譜條件:色譜柱:Kromasil NH2(4.6×250 mm,5 μm);流動(dòng)相 :乙腈 -水 (體積比 80∶20);流速 :1 mL/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:20μL;ELSD的漂移管溫度90℃;氮?dú)庾鬏d氣;流速:1.5 mL/min;載氣壓力:0.1 MPa。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥冬多糖的分離純化及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

純麥冬多糖經(jīng) Sephadex G-100柱洗脫后,其洗脫曲線呈單一對(duì)稱峰,結(jié)果見(jiàn)圖1;紫外吸收光譜掃描結(jié)果無(wú) 260～280 nm范圍內(nèi)的吸收峰,表明該多糖中不含有蛋白質(zhì)和核酸;與純化前麥冬粗多糖進(jìn)行 TLC比對(duì),純化后的多糖可以看到清晰的單一點(diǎn),且沒(méi)有拖尾現(xiàn)象,見(jiàn)圖2。

圖1 Sephadex G-100分離純麥冬多糖柱層析圖譜

圖2 麥冬多糖經(jīng) Sephadex G-100純化前后 TLC圖

由以上結(jié)果可以證明純麥冬多糖是組分較為均一的多糖。由圖1可知,純麥冬多糖的洗脫體積Ve為 65.2 mL。通過(guò)方法 1.3.4中的回歸方程求得純麥冬多糖的相對(duì)分子質(zhì)量為 48 347。

2.2 純麥冬多糖酶解產(chǎn)物的分離

純麥冬多糖經(jīng)方法 1.3.3.2反應(yīng)后,酶解產(chǎn)物用Sephadex G-100柱進(jìn)行分離,苯酚-硫酸法檢測(cè),洗脫曲線見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出,洗脫曲線出現(xiàn)了 3個(gè)洗脫峰,且都為單一對(duì)稱峰,說(shuō)明組分均一的純麥冬多糖經(jīng)Absidiasp.O8s菌株產(chǎn)生的酶水解后,得到 OP-1、OP-2、OP-3三種新組分,同時(shí)也表明,該酶能部分水解麥冬多糖。

圖3 Sephadex G-100分離麥冬純多糖酶解產(chǎn)物柱層析圖譜

2.3 OP-1、OP-2、OP-3相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

OP-1、OP-2、OP-3經(jīng) Sephadex G-100柱洗脫后的洗脫體積Ve分別為 77.8 mL、119.4 mL和 147.2 mL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得回歸方程,可得OP-1和OP-2的相對(duì)分子質(zhì)量分別為 32 452和 9 231。

由于 Sephadex G-100凝膠柱的總體積Vt為146.9 mL,可知OP-3的相對(duì)分子質(zhì)量不在分離范圍之內(nèi)。使用 Sephadex G-50柱測(cè)定 OP-3的相對(duì)分子質(zhì)量,OP-3經(jīng) Sephadex G-50柱洗脫后的洗脫體積Ve為154.1mL。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算得OP-3的相對(duì)分子質(zhì)量為 1 354。

2.4 純麥冬多糖及其酶解產(chǎn)物的單糖組成分析

5種標(biāo)準(zhǔn)單糖混合的 HPLC圖譜見(jiàn)圖4,與單一標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間對(duì)照,可知圖4中各峰所代表的單糖組分,結(jié)果見(jiàn)表1。

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖 HPLC圖

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖 HPLC圖解析

純麥冬多糖及其酶解產(chǎn)物 OP-1、OP-2、OP-3經(jīng)方法 1.3.5完全水解后,通過(guò) HPLC分析,結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 多糖酸解產(chǎn)物的 HPLC圖

純麥冬多糖經(jīng)完全酸解后,HPLC圖譜顯示出現(xiàn) 2個(gè)峰,保留時(shí)間分別是 7.496 min和 8.401 min,與標(biāo)準(zhǔn)品:果糖 (7.432 min)、葡萄糖 (8.332 min)的保留時(shí)間相近,說(shuō)明純麥冬多糖的單糖構(gòu)成是果糖和葡萄糖。

OP-1和 OP-2酸解后,HPLC圖譜均出現(xiàn) 1個(gè)峰,保留時(shí)間分別為 7.415 min和 7.394 min,與標(biāo)準(zhǔn)品果糖 (7.432 min)相近,說(shuō)明 OP-1和 OP-2的單糖組成是果糖。

OP-3酸解后的 HPLC圖譜顯示出現(xiàn) 2個(gè)峰,保留時(shí)間分別是 7.467 min和 8.379 min,與標(biāo)準(zhǔn)品:果糖 (7.432 min)、葡萄糖 (8.332 min)的保留時(shí)間相似,說(shuō)明OP-3的單糖組成也是果糖和葡萄糖。

3 結(jié)論

綜合上述分析結(jié)果可知,相對(duì)分子質(zhì)量為 48347的純麥冬多糖經(jīng)Absidiasp.O8s菌株產(chǎn)生的酶水解后,產(chǎn)物由 OP-1、OP-2、OP-3 3部分組成,相對(duì)分子質(zhì)量分別為 32 452、9 231、1 354。HPLC分析結(jié)果表明 ,純麥冬多糖的單糖組成為葡萄糖和果糖,其水解產(chǎn)物 OP-1、OP-2、OP-3三種組分的單糖組成分別為果糖、果糖、葡糖糖和果糖。結(jié)果說(shuō)明,Absidiasp.O8s菌株產(chǎn)生的酶可以水解麥冬多糖,使相對(duì)分子質(zhì)量較大的純麥冬多糖降解,得到了相對(duì)分子質(zhì)量小于 1萬(wàn)的多糖組分。從酶解產(chǎn)物的單糖組成初步可知,該酶能夠水解麥冬多糖中的部分果糖糖苷鍵,有關(guān)具體糖苷鍵的鍵位斷裂情況,還有待進(jìn)一步研究。

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