一株嗜熱菌木糖異構酶的純化與性質研究＊

張波,殷燕

木糖異構酶 (xyloseisomerase,XI,EC 5.31.1.5),又稱葡萄糖異構酶,此酶在細胞內可將五碳糖D-木糖轉化為D-木酮糖,在微生物體內的糖代謝過程中起著重要的作用。在體外可轉化葡萄糖形成果糖,并已經用于高果糖漿的工業生產,是一種重要的工業用酶。目前用于生產的木糖異構酶多來自Streptom yces,Actinoplanes,Flavobacterium等常溫菌,其催化產物需要借助層析等濃縮步驟方可得到 55%的高果糖漿[1]。若能升高異構化反應的溫度則有利于反應向著果糖生成的方向移動。因此尋找和開發耐熱木糖異構酶有望減少生產步驟,直接獲得高果糖漿[2]。近年研究發現,在一定條件下木糖異構酶還可催化生產許多制藥工業重要的原料稀有糖,如核糖、甘露糖、阿拉伯糖、來蘇糖等。對于高溫菌產生的木糖異構酶,Kitada[3]報道了 1株B acillusTX-3可以在 55℃下生產木糖異構酶,酶的最適反應溫度達到80℃;Lehmacher[4]也報道了,在 85℃催化異構化反應的嗜熱酶,但國內相關研究較少。本文研究了 1株從云南騰沖溫泉水樣中篩選的嗜熱菌 (Anoxybacillus flavither m us)所產木糖異構酶的分離純化以及酶學性質。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與培養基

嗜熱菌Anoxybacillus flavither m usWL,分離自云南騰沖溫泉[5]。

培養基:木糖 10 g,蛋白胨 2 g,酵母提取物 2 g,Na2S2O3·5H2O 1 g,Na2S·9H2O 0.3 g,MgSO40.2 g,無機鹽溶液 10 mL,定容至 1 L,pH 7.5。

無機鹽溶液:MnSO4· H2O 0.5 g,CuSO4·5H2O 0.01 g,CoCl2·6H2O 0.045 g,FeSO4·7H2O 0.1 g,ZnSO4· 7H2O 0.5 g,定容至 1 L。

固體培養基加入瓊脂粉 17.0 g,115℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

1.2 木糖異構酶活性測定方法

采用半胱氨酸-咔唑法測定酶活性[6]:0.1 mol/LD-木糖 50μL,酶液 50μL,10 mmol/L MgCl250μL,85℃反應 15 min,沸水浴終止反應。取 100μL立即加入 13 mol/L的 H2SO46 mL,1.5%半胱氨酸鹽酸鹽溶液 0.2 mL,0.12%咔唑酒精溶液 0.2 mL,混勻,室溫放置 2 h,于 540 nm處測定光吸收。據木酮糖標準曲線求得木酮糖量。酶活單位定義為:每分鐘催化產生 1μmol木酮糖的酶量為 1個酶活力單位。

1.3 粗酶液制備及酶的純化

1.3.1 粗酶液的制備

取發酵液離心收集菌體,用 5 mmol/L Tris-HC1(pH 7.5)離心洗滌 2次,菌體重新懸浮于緩沖液中,低溫超聲波破碎細胞 20 min,離心 (4℃ 10 000 r/min),上清液即為粗酶液。

1.3.2 木糖異構酶的分離純化

硫酸銨沉淀得到粗酶制品。酶的純化步驟為:首先采用 Sephadex G-75凝膠過濾對粗酶進行純化,然后再進行兩步陰離子交換層析來進行進一步的純化(第一步陰離子交換層析柱分離采用纖維素 DE-52弱陰離子交換柱,第二步陰離子交換層析柱分離采用Q Sepharose Fast Flow強陰離子交換柱離子交換層析)。用溶于相同緩沖液的 0～1.0 mol/L NaCl鹽溶液進行梯度洗脫,收集活性峰,測定蛋白濃度和酶活,酶液冷凍干燥后溶于 pH7.5,20 mmol/LTris-HCl緩沖液中透析 18h后上 QSFF柱。20 mmol/L,pH7.5的 Tris-HCl緩沖溶液作為初始緩沖液,流速 0.5 mL/min,0～1.0 mol/L NaCl鹽溶液進行梯度洗脫,收集活性峰,測定蛋白濃度和酶活。純化后的樣品置-20℃冷凍保存備用。

1.3.3 SDS-PAGE和 Native-PAGE電泳

Native-PAGE電泳又稱未變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術,即在不加入 SDS、疏基乙醇等變性劑的條件下對保持活性的蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,這樣可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷,尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性。電泳后分別剪下酶條帶,用 pH7.5,20 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗滌 3次,研缽碾碎,樣品加入適量 pH7.5,20 mmol/L Tris-HCl緩沖液,4℃下浸泡 24h,10 000 r/min離心 10 min除去凝膠,上清液即為純酶溶液,測定蛋白濃度和酶活。

SDS-PAGE電泳又稱變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術。取酶液進行 SDS-PAGE電泳。樣品 10 000 r/min離心 10 min后取上清液上樣,進樣量 25μL。具體操作條件和步驟見文獻[7]。

1.3.4 木糖異構酶酶學性質的研究

木糖異構酶最適反應溫度的測定:反應溫度分別為 40、50、60、70、75、80、85、90、95℃,測定酶活性。

木糖異構酶最適反應 pH的測定:反應的緩沖液pH分別為 pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,測定酶活性。

金屬離子對酶活性的影響:分別向酶和底物的反應體系中加入終濃度為 0.5 mmol/L的 ZnSO4、CaCl2、CoCl2、MgSO4、FeSO4、AlCl3、CuSO4代替之前的 Mn-SO4,測定酶活性,同時以不添加金屬離子的為對照組。

木糖異構酶熱穩定性的測定:將酶液分別在 40、50、60、70、75、80、85、90、95℃保溫 1h后測定剩余酶活力,研究該酶的熱穩定性。

木糖異構酶酸堿穩定性的測定:將酶液分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0緩沖液中 60℃保溫 1h后測定剩余酶活力,研究該酶的酸堿穩定性。

2 結果與分析

2.1 木糖異構酶的分離純化

來源于Anoxybacillus flavither m usWL的木糖異構酶,經過硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析、兩步陰離子交換層析后,檢測蛋白濃度和酶活,酶的純化倍數約為7.9倍。結果見圖1～圖3。

圖1 菌株WL XI Sephadex G-75凝膠過濾層析譜圖

圖2 菌株WL XI纖維素 DE-52離子交換層析

圖3 菌株WL XIQ Sepharose Fast Flow離子交換層析譜圖

2.2 木糖異構酶的 SDS-PAGE和 Native-PAGE電泳分析

圖4 為各級純化處理酶液與標準蛋白在同一條件下進行的 Native-PAGE電泳圖譜,其中條帶 4顯示的是 2步陰離子交換層析分離純化得到的 3條蛋白帶。將此 3條蛋白帶分別剪下取出,分別測定木糖異構酶活性,其中分子質量為 181 ku的蛋白帶具有木糖異構酶活性 (酶活測定為 12U/mg),其他 2條蛋白帶無木糖異構酶活性,表明條帶 4中分子量約為 181 ku的蛋白帶為木糖異構酶,結果見圖4。經 Native-PAGE電泳后分離得到的木糖異構酶蛋白與標準蛋白在同一條件下進行 SDS-PAGE電泳,與標準蛋白的分子量比較,酶的分子質量約為 45 ku,結果見圖5。綜合圖4和圖5的結果表明,該酶蛋白分子質量約為181 ku,由 4個分子質量約為 45 ku的亞基組成。

圖4 XINative-PAGE電泳圖譜

圖5 XI SDS-PAGE電泳圖譜

2.3 木糖異構酶的的酶學性質

2.3.1 溫度對酶活性的影響

由圖6可知,酶反應的最適溫度為 80℃,在較低溫度下該酶的活性很低。

2.3.2 pH值對酶活性的影響

由圖7可知,pH值 4.0至 pH值 5.0時,酶活極低,而 pH 5.0至 pH 6.0時,酶活急劇上升,pH7.0至pH 8.0時,酶活處于穩定狀態。從 pH 8.0開始酶活降低但至 pH 11.0時酶活仍保持較高水平。酶的最適 pH約在 7.0左右。

2.3.3 木糖異構酶穩定性研究

圖6 溫度對 XI活性的影響

圖7 pH對 XI活性的影響

木糖異構酶分別在不同的溫度下水浴保溫 1h后的剩余酶活如圖8所示,在無底物存在的條件下,60℃保溫 1 h后酶活仍保持近 100%,70℃保溫 1 h后酶活仍能保持近 80%,但在 70℃以上,隨溫度上升酶活性明顯下降,至 80℃時酶活性幾乎全部消失。

圖8 XI的熱穩定性

木糖異構酶分別在不同 pH的緩沖液中無底物存在的條件下,保溫 1 h后的剩余酶活如圖9所示,pH 4.0時酶活很低,隨 pH增大酶活性明顯上升,pH 5.0時酶活近 100%。pH 5.0至 pH 8.0之間酶活性穩定保持在 80%以上,在 pH 9.0以上,隨 pH增大酶活性明顯下降,但直到 pH 12.0時酶活性仍能保持40%左右。

2.3.4 金屬離子對木糖異構酶活性的影響

添加不同的金屬離子對菌株Anoxybacillus flavither m usWL木糖異構酶活性的影響見表1,Ca2+、Co2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+均對酶活有促進作用 ,尤以Mn2+和 Co2+對酶活的促進作用明顯,Zn2+、Cu2+以及 Al3+對酶活有一定程度的抑制作用。

圖9 XI的酸堿穩定性

表1 金屬離子對酶活性的影響

3 討論

木糖異構酶作為微生物利用木糖的關鍵酶一直受到國內外的關注。目前國內外已報道的 XI分子量通常在 180-200 ku。如從Streptom ycessp.SK中分離得到的葡萄糖異構酶分子量在 180 ku左右,由 4個相同分子量的亞基組成,屬于分子量較小的一類[8];從Clostridium ther m osulfurogenes和Ther m oanaerobacter等分離得到的葡萄糖異構酶均為分子量 200 ku的同型四聚物,分子量相對較大[9-10]。本實驗從嗜熱菌Anoxybacillus flavither m us分離得到的木糖異構酶,分子量約 181 ku,由 4個相同分子量的亞基組成。具有極好的熱穩定性和酸堿穩定性,70℃保溫 1 h后酶活仍能保持近 80%,pH5.0～pH8.0范圍內酶活性保持在 80%以上。當前谷物轉化為果糖糖漿主要是采用中溫型微生物的葡糖異構酶將葡萄糖異構化為果糖,但中溫型微生物的葡糖異構酶的熱穩定性不高,最適作用溫度為 60℃,在這個溫度下果糖產量不高。目前已從嗜熱菌中分離了一些熱穩定的木糖異構酶,并進行了研究。如 1997年 Park[11]等從Ther m us favusAT62中分離純化了一種木糖異構酶 (XylA),該酶為一種四聚體,其分子量為 185 ku,最適作用溫度為90℃,最適 pH值 7.0,其催化活性需要二價陽離子如Mn2+、Co2+和Mg2+的存在。嗜熱古細菌菌株 JWPSL2YS 489能產生一種分子質量為 200 ku的木糖異構酶,其催化活性同樣需要二價陽離子如Mn2+、Co2+和Mg2+的存在。在缺少底物的情況下,82℃處理 1 h該酶仍然穩定[12]。從T.m aritim a分離純化得到的熱穩定性葡萄糖異構酶,當溫度達到 100℃時,其活性保持不變;當溫度繼續上升到 115℃時,10 min后仍有 50%的酶活[13]。雖然嗜熱菌所產生的酶耐高溫,適合于高溫條件的工業生產,但要使之用于大規模的工業生產還存在一些目前尚未解決的問題,如一般嗜熱微生物培養條件比較苛刻;大規模發酵生產需要特殊的設備;產酶效率較低等等。這些因素限制了它們的應用。還需要通過各種方法和手段從極端環境中篩選,或通過育種,或采用分子生物學手段等得到抗性更強、酶活更高的嗜熱酶生產菌株,從而實現耐高溫木糖異構酶在工業生產中的應用。本實驗篩選的嗜熱菌Anoxybacillus flavither m usWL生長快,容易培養,產生的木糖異構酶熱穩定性和酸堿穩定性良好,有望用于生產和應用。

4 結論

本課題研究的嗜熱菌所產的酶為木糖異構酶,分子量為 181ku,由 4個相同分子質量的亞基組成。酶的最適反應溫度為 80℃,最適 pH值 7.0。70℃保溫1h后,酶活保持近 80%,pH5.0～pH8.0內保溫 1h,酶活保持 80%以上。Mn2+和 Co2+對酶活性有明顯促進作用。Zn2+、Cu2+、Al3+對酶活有一定程度的控制。

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