硫酸酯化米糠多糖結構分析及其抗腫瘤活性研究＊

王莉,朱麗丹,盛慧明,陳正行

近年來諸多研究發現,多糖及其衍生物在抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗凝血等方面發揮著生物活性作用,多糖在醫藥上作為免疫調節劑用來治療腫瘤、肝炎等疾病已為大家所廣泛接受[1-3]。但由于多糖結構的復雜性,其生物活性隨多糖來源及其產生的多糖種類不同而差異較大,另外多糖一般都具有較大的分子質量,水中溶解性較差,這給多糖的實際應用造成了一定的困難。采取一定的方法對多糖結構進行適當修飾,能提高多糖的生理活性,其中硫酸化修飾是目前多糖結構修飾中研究得最而且效果突出的一種修飾手段。

生物活性物質的活性高低與其結構有著密切的關系,分子結構的微小變化和立體結構因素都會影響其活性[4]。許多研究已經證實,硫酸酯化多糖的生物活性與幾個結構參數密切相關,如硫酸酯化度,分子量,硫酸酯化的位置,糖的種類及主鏈和分支結構[5]。目前對硫酸酯化米糠多糖的分子結構研究尚屬空白,本實驗對 SRBPS2a的結構特點進行初步的研究,并通過建立小鼠抑制乳腺癌 EMT-6模型,研究了 SRBPS2a在體外和體內抗腫瘤作用機理,為以后進一步研究 SRBPS2a的構效關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

脫脂米糠,浙江省杭州市中谷油脂有限公司提供,-4℃保存,耐高溫;RP M I 1640細胞培養基,GI BCO公司;小鼠乳腺癌細胞 EMT-6,北京市腫瘤醫院動物實驗中心提供;BALB/C雌性小鼠,6周齡,體重(18±2)g,中科院動物實驗中心;小牛血清,杭州四季青生物公司;二甲亞砜、MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoloium],Sigma公司;其余試劑為國產分析純。

高效液相色譜儀,美國 Waters公司;Nexus-470傅立葉變換紅外光譜儀,美國 Ther mo fisher scientific公司;Bruker Avance 500核磁共振波譜儀,美國Bruker公司;CO2培養箱,美國 Thermo公司;WFZ UV-2100紫外可見分光光度計,尤尼柯上海儀器有限公司;VCX500型超聲波破碎機,美國 Sonics&materials公司;BSZ-100自動部分收集器、TH-1000型梯度混合器,上海青浦滬西儀器廠;HL-2S型恒流 、HD-5電腦紫外檢測儀,上海滬西分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 硫酸酯化米糠多糖 SRBPS2a的制備

根據文獻[6]提取和純化 RBPS2a。

采用氯磺酸-吡啶法[4]對 RBPS2a進行硫酸酯化。準確稱取 400 mg的 RBPS2a并將其懸浮于 35 mL N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)中,加入配置好的酯化試劑,在一定溫度下攪拌反應 1～3 h,反應結束后用4 mol/L NaOH中和至 pH值為 7。加入體積分數95%乙醇,使醇濃度為 70%,離心分離后將沉淀溶于蒸餾水,流水透析 72 h,蒸餾水透析 12 h,真空濃縮、冷凍干燥得到 SRBPS2a。

根據 Dodgson and Price的方法[7]測定 SRBPS2a硫酸基含量。

1.2.2 分子質量的測定 (HPGPC)

采用高效液相凝膠滲透色譜法測定 SRBPS2a的分子質量。采用 TSK及 Ultrahydrogel linear(7.8 mm×300 mm)色譜柱,雙柱串聯,Waters-2410型示差折光檢測器檢測,流動相為 0.1 mol/L NaNO3,流速為0.9 mL/min,柱溫 45℃,進樣量 20μL,記錄樣品色譜曲線。在相同的 HPLC測定條件下,將 7種分子質量為 6 100、16 500、26 290、40 000、84 000、158 000和291 000的標準Dextran相繼進樣,記錄各自的保留時間TR,以TR為橫坐標LgM為縱坐標,繪制標準曲線。相同條件下得到樣品 SRBPS2a的色譜曲線,采用Millennium 2010(Waters)軟件分析樣品的保留時間得到樣品的相對分子質量。

1.2.3 傅立葉變換紅外光譜 (FT-IR)

利用NicoletNexus 470型紅外光譜儀檢測 SRBPS2a的功能性官能團。將 SRBPS2a與溴化鉀壓片,在 4 000～400 cm-1范圍內掃描,掃描 32次,分辨率 4 cm-1。

1.2.413CNMR

用D2O配成 30 mg/mL濃度的樣品溶液,室溫下利用BrukerAvance 500 NMR核磁共振儀進行分析測定。

1.2.5 體外抗腫瘤試驗

利用MTT法[8]來評價 SRBPS2a抑制小鼠乳腺癌細胞 EMT-6的能力。取對數生長期的小鼠乳腺癌細胞 EMT-6培養于 RPM I 1640完全培養液中,放入37℃CO2培養箱中培養,接種時細胞濃度調整為 (3～5)×105/mL,將細胞加入 96孔培養板中,每孔 150 μL,置于 37℃、5%CO2培養箱培養 24 h,再加入用完全培養基稀釋成不同濃度的樣品溶液 150μL,空白對照組加入等體積的 RPM I1640完全培養基,每組設 4個復孔,將細胞培養板移入 CO2培養箱中,培養48 h后MTT法于 570 nm波長下測定其吸光值,計算各種腫瘤細胞增殖抑制率。抑制率計算公式如下:

1.2.6 體內抗腫瘤試驗

1.2.6.1 動物模型建立

收集培養至對數生長期的 EMT-6細胞,用生理鹽水將細胞濃度調整為 1×107個 /mL,于小鼠右前肢進行無菌皮下接種,每只小鼠接種 0.2 mL細胞懸液,即細胞總數為 2×106個,待小鼠瘤體積達到 500 mm3左右進行實驗。

1.2.6.2 給樣方式

將建模成功的小鼠分組與給樣。方案如下:荷瘤小鼠隨機分成 5組,每組 12只,次日開始注射待測樣品 SRBPS2a,樣品設低、中、高 3個劑量 ,即 25、50、75 mg/(kg·d)體重;陽性對照組給予用生理鹽水稀釋的五氟尿嘧啶 (5-FU)20 mg/(kg·d)體重 ,每日灌胃給藥一次,每次每鼠給藥體積為 0.2 mL,連續 10 d;陰性對照組每日給予等量無菌 0.9%生理鹽水。

1.2.6.3 抑瘤率測定

停藥 24 h后斷頸處死荷瘤小鼠,剝離瘤塊,稱重并計算腫瘤抑制率。腫瘤生長抑制率按下式計算:

1.2.7 相對胸腺和脾臟的質量

取停藥后 24 h后處死荷瘤小鼠的脾臟和胸腺,稱重并按下式計算脾指數和胸腺指數。脾指數和胸腺指數按下式計算:

1.2.8 數據分析

所測數據以表示,如果數據符合正態分布,統計方法采用雙側t檢驗,α=0.05,如數據不符合正態分布,則采用 F檢驗。

2 結果與討論

2.1 硫酸酯化米糠多糖 SRBPS2a的結構分析

2.1.1 硫酸酯化米糠多糖 SRBPS2a的分子質量

硫酸酯化可以通過結構修飾從而改變多糖的空間結構、分子質量及取代基種類、數目和位置而對其活性產生影響,其中分子質量是一個非常重要的參數[9]。

高效液相凝膠滲透色譜 (HPGPC)分析顯示SRBPS2a呈單一對稱譜圖,為相對單一組分,據標準曲線得出其相對分子質量 (Mw)為 3.5×105u。與修飾前的 RBPS2a分子質量 9×105u相比,硫酸酯化修飾之后的多糖分子質量明顯變小,說明在強酸性的酯化過程中,由于氯磺酸強大的脫水能力,使多羥基多糖脫水并降解,從而使 SRBPS2a分子質量變小。用Dodgson and Price的方法測定 SRBPS2a取代度為1.29。有研究發現,當 DS在 0.9～1.3內,有助于提高了 SRBPS2a的抗腫瘤活性[4]。

2.1.2 硫酸酯化米糠多糖 SRBPS2a的紅外光譜

圖1為 SRBPS2a的紅外光譜圖。1 263和 1 044 cm-1的吸收峰分別是 S=O的彎曲振動和伸縮振動,830 cm-1的吸收峰和 1 137 cm-1為 C—O—S的拉伸振動和伸縮振動,這些都是硫酸酯的特征吸收峰[10]。580 cm-1的吸收峰通常出現在硫酸酯化多糖中[11]。與 RBPS2a的紅外光譜圖相比較[6],證明硫酸基已與米糠多糖結合形成硫酸酯。800～850 cm-1表明了硫酸基團取代位置的吸收區域。其中 845 cm-1和 830 cm-1處的吸收峰表明了 SRBPS2a的硫酸基團在 C-2位和 C-4位上發生了取代,而在 820 cm-1處未顯示吸收峰,表明 C-6上沒有發生取代[12]。

圖1 硫酸酯化米糠多糖 SRBPS2a的紅外光譜

2.1.3 硫酸酯化米糠多糖 SRBPS2a的核磁共振分析

NMR用于檢測組成有機化合物分子的原子核性質及其與周圍化學環境的相互作用,一維核磁共振氫譜 (1H-NMR)和一維核磁共振碳譜 (13C-NMR)可為多糖的結構分析提供有用的信息。RBPS2a的核磁共振分析在文獻[12]有詳細的介紹。

表1為 SRBPS2a的13C譜圖的化學位移。與酯化之前 RBPS2a的核磁譜圖相比較,α-D-木糖,α-D-阿拉伯糖,α-D-葡萄糖和α-D-阿拉伯糖的異頭碳信號均消失,說明硫酸酯化改性的過程中,多糖僅保留了β-(1→3)-D-半乳糖的主鏈結構,其側鏈被切除。SRBPS2a的 C-2的部分信號由 75.6 ppm轉移至 81.3 ppm,說明部分 C-2位上的羥基被硫酸基團所取代;在 77.4 ppm出現的新的信號歸屬于 C-4位,表明硫酸基團取代也發生在 C-4位上。同時,由于在 C-2和C-4位置上發生了取代,影響了 C-1的信號,因此在101.0 ppm處出現了與 C-1相關的信號。61～64 ppm之間的與 C-6相關的信號消失,而在 56.6 ppm處 O-CH3信號的出現,表明在硫酸酯化的過程中,C-6位置發生了氧化降解同時有甲氧基的產生,推測 C-6被氧化成了糖醛酸甲酯[15]。綜上所述,RBPS2a在經過硫酸酯化修飾后,主鏈為β-(1→3)-D-半乳糖,其側鏈被切除,硫酸基團的取代發生在 C-2和 C-4位上,C-6氧化形成了糖醛酸甲酯。

表1 SRBPS2a的13C NM R化學位移

2.2 硫酸酯化米糠多糖 SRBPS2a抗腫瘤活性

2.2.1 體外抗腫瘤試驗

許多研究表明,硫酸酯化衍生物對腫瘤細胞的增殖抑制跟其的取代度有關,多糖的取代度的越高的,在體內抗腫瘤細胞能力越強[9]。如表2為 SRBPS2a對 EMT-6體外腫瘤細胞的增殖抑制作用——當SRBPS2a在劑量濃度為 500和 250 mg/mL時,比 RBPS2a對 EMT-6體外腫瘤細胞有顯著的抑制作用 (P＜0.05);當 SRBPS2a和 RBPS2a劑量濃度為 500 mg/mL時對 EMT-6體外腫瘤細胞的抑制力分別為47.35%和 31.58%;RBPS2a在劑量濃度為 100和 50 mg/mL時無明顯的抑制作用。這表明 SRBPS2a比RBPS2a對 EMT-6體外腫瘤細胞有更好的抑制作用。

硫酸酯化修飾通常認為是提高多糖的生物活性的一種有效方法。引入硫酸基后所引起的多糖立體結構的變化,糖環構象可能扭曲或轉變,且硫酸基間的排斥作用導致卷曲構象呈伸展和剛性狀態。有研究表明:分子質量的降低,側鏈的切除,硫酸基團的取代和多糖糖鏈剛性的增加可能有助于提高多糖的抗腫瘤活性[13]。

表2 不同濃度下 RBPS2a及其 SRBPS2a對 E MT-6體外腫瘤細胞的增殖抑制作用

2.2.2 體內抗腫瘤試驗

SRBPS2a對 EMT-6荷瘤小鼠的體內抑瘤作用如表3所示。結果表明,陽性對照組 (5-FU)的抑瘤率為 73.81%,而不同劑量濃度的 SRBPS2a對 EMT-6荷瘤小鼠表現出不同抗腫瘤活性。SRBPS2a在劑量濃度為 75mg/kg有顯著的抑制腫瘤細胞生長作用,腫瘤抑制率達 55.95%。

陰性對照組平均瘤重為 (0.84±0.21)g,然而陽性對照組平均瘤重為 (0.22±0.09)g,相比與陰性對照組顯著減少,注射 SRBPS2a劑量濃度為 75和 50 mg/kg的小鼠平均瘤重為 (0.37±0.11)和 (0.47±0.18)g。實驗結果表明,硫酸酯化多糖對小鼠體內EMT-6的生長具有明顯的抑制作用。陽性對照組 (5-FU)有較高的抗腫瘤作用,但也有很強的毒副作用,如體重和脾臟的質量明顯下降的影響。實驗中發現,SRBPS2a試驗組的食欲、精神、皮毛光澤度明顯優于陰性和陽性對照組,且未觀察到有副作用和體重減輕。

如表3所示,陽性對照組小鼠胸腺指數和脾指數相對于陰性對照均有顯著的降低;SRBPS2a組脾指數相對于陰性對照組有顯著的增加,但胸腺指數無顯著差異。這些結果表明,SRBPS2a能增加免疫器官的重量。作為一個最有效的抗癌藥物,5-FU被用于通過化療對抗各種實體腫瘤[14],然而,由于毒性累積和抗藥性的發展,連續使用 5-FU的并不總是可行的。一些多糖或其衍生物除了他們的生物活性還被認為能影響許多癌癥化療的敏感性[15-16]。SRBPS2a由于其對腫瘤細胞株較好的抑制率且沒有毒副作用,被認為是一種具有發展潛力的抗腫瘤藥物。

表3 SRBPS2a對 EM T-6荷瘤小鼠的體內抑瘤作用

3 結論

采用氯磺酸-吡啶法將米糠多糖合成硫酸酯化米糠多糖,得到了取代度為 1.29,分子質量為 3.5×105u,具有顯著體外抗腫瘤活性的米糠多糖硫酸酯化衍生物 SRBPS2a,且硫酸基團的取代發生在 C-2和 C-4位上。以腫瘤細胞體內和體外增殖抑制為指標表明,SRBPS2a明顯比 RBPS2a有更好的抑制腫瘤的能力。由于 SRBPS2a具有很好的的抗腫瘤活性,可以在將來成為是一種用于治療癌癥、低副作用的藥品,也為SRBPS2a進一步研究誘導腫瘤細胞凋亡及分子機制提供可能。

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