畢赤酵母工程菌 pk53產纖溶酶發酵條件的優化＊

焦龍,于宏偉,郭潤芳,白玉,賈英民

人體內的血栓常引發嚴重的心血管疾病,發病突然,死亡率極高,溶栓治療是搶救與治療此類疾病的常用手段[1]。纖溶酶能分解血栓的主要骨架纖維蛋白從而溶解血栓,以恢復血流通暢,促進組織恢復。該酶在發揮溶栓作用時,不水解血漿纖維蛋白質,故不易引起出血傾向,因此具有廣闊的研究開發前景[2]。

巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)表達系統是目前最優秀、應用最廣泛的外源基因表達系統之一[3],它在表達異源蛋白上具有諸多優點[4],能使外源真核基因正確地翻譯和翻譯后加工,并能對許多蛋白質產物進行分泌,使產物易于提純。目前畢赤酵母工程菌搖瓶培養所采用的培養基是用以甘油為碳源的細胞增殖培養基 (BMGY)作為基礎生長培養基,然后用以甲醇為碳源的誘導培養基 (BMMY)表達產酶。BMGY與 BMMY價格昂貴,不適宜工業化生產[5]。本實驗在前期已構建產纖溶酶的基因工程菌菌株基礎上,對產纖溶酶畢赤酵母基因工程菌的培養基進行研究,旨在找到一種廉價的培養基配方,并對其液態發酵條件進行優化,以確定最佳產酶條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

畢赤酵母工程菌 (pichia pastoris)pk53:河北農業大學食品科技學院酶工程實驗室構建并保存。

1.1.2 培養基

10 ×D(20%Dextrose,葡萄糖 ):將 200 gD-葡萄糖溶于 1 000 mL去離子水中,過濾除菌或高壓滅菌 15 min,4℃保存備用。

YPD培養基[6]:稱取蛋白胨 20 g,酵母抽提物 10 g溶于 900 mL去離子水中,高壓滅菌 20 min,冷卻后加入 100 mL 10×D貯液,4℃保存,制備平板時加 15 g/L瓊脂粉。

基礎生長培養基:甘油 1%,豆粕粉 2%,KH2PO40.3%,MgSO4·7H2O 0.03%,pH 6.0。

誘導培養基:甲醇 1%,豆粕粉 2%,KH2PO40.3%,MgSO4·7H2O 0.03%,pH 6.0。

1.2 方法

1.2.1 種子培養

將基因工程菌劃線于 YPD平板,28℃培養至長出單菌落。從平板挑單菌落到 YPD液體培養基中,搖床 28℃,200 r/min培養 12 h,作為接種用的種子。

1.2.2 發酵培養

在 250 mL三角瓶中裝入發酵培養基 30 mL,種子接種量為 1%,200 r/min,28℃恒溫振蕩培養 24 h后,將菌體接入搖瓶誘導培養基,每隔 24 h再添加1%甲醇誘導培養 144 h。在 96、108、120、132 h分別取發酵液,離心取上清液作為粗酶液,測定酶活和OD600。將最大酶活力,最大 OD600設為 100%。

1.2.3 酶活測定

定性酶活測定采用纖維蛋白平板法與采用分光光度計法[7]。

1.2.4 生物量測定

采用細胞光密度 (OD600)分析法:將菌液稀釋后,于波長 600 nm處,以去離子水為對照進行比色測定。OD600=OD600讀數 ×稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基的優化

2.1.1 生長階段不同碳源對產酶的影響

分別以 1%葡萄糖、糊精、蔗糖、玉米粉、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油和麩皮為唯一碳源替代基礎培養基中碳源進行培養工程菌 pk53,結果如圖1。在供試碳源中,工程菌 pk53在糊精中生長最好,但促進產酶能力較低;在麩皮中生長良好,促進產酶能力最高;其他碳源對產酶促進能力均有所下降。麩皮具有來源廣泛,價格低廉,營養豐富的特點,因此選擇其作為碳源。

圖1 不同碳源對產酶和生長的影響

2.1.2 生長階段不同氮源對產酶的影響

分別以 2%豆粕粉、蛋白胨、氨水、牛肉膏、(NH4)2SO4、NH4NO3、KNO3為唯一氮源進行培養 ,結果 (圖2)發現 ,無機氮源 (NH4)2SO4、NH4NO3、KNO3促進產酶能力相對較低且不利于菌體生長,而有機氮源有利于促進產酶且菌體生長量較大,其中以豆粕粉為氮源時對菌體產酶促進能力最大。

圖2 不同氮源對產酶和生長影響

2.1.3 誘導階段不同氮源對產酶的影響

分別以 2%豆粕粉、蛋白胨、氨水、牛肉膏、(NH4)2SO4、NH4NO3、KNO3為唯一氮源進行培養 ,結果 (圖3)發現,有機氮源有利于產酶且菌體生長量較大,其中以蛋白胨為氮源時發酵液酶活最大,牛肉膏、豆粕粉次之,但蛋白胨、牛肉膏相對價格較高,因此本試驗采用豆粕粉作為菌株發酵產纖溶酶的最適誘導氮源。在無機氮源中,以氨水的產酶和菌體生長量為最高。(NH4)2SO4、NH4NO3、KNO3產酶活力和菌體生長量相對較低,可能是這些氮源缺少酶合成所需要的某種成分。

圖3 不同氮源對產酶和生長影響

2.1.4 培養基成分的正交試驗

對 3個主要營養源:麩皮、豆粕粉、KH2PO4的不同配比對菌株產酶促進能力的協同效應進行了研究。采用正交實驗,試驗數據和處理結果見表1。依據正交試驗的直觀分析結果,極差值R(麩皮)＞R(KH2PO4)＞R(豆粕粉),因此 ,麩皮為主要影響因素 ,KH2PO4的影響次之,豆粕粉的影響最小。最佳組合為 A3B1C3D2。由表2的方差分析結果看出,麩皮、KH2PO4對產酶促進能力影響差異極顯著,豆粕粉對產酶促進能力影響差異不顯著。在試驗因子水平范圍內,促進產酶能力最高的組合為 A3B1C3D2,由于正交試驗處理中包含有該工藝條件組合,因此在該因子組合下進行發酵試驗。結果表明,在優化的培養基條件下發酵,纖溶酶活力為 110.92 U/mL。根據單因素及正交試驗結果,確定培養基優化配比為:麩皮 1.5%、豆粕粉 2%、KH2PO40.5%。

2.2 發酵條件的優化

2.2.1 種齡對工程菌 pk53產酶的影響

分別取處于對數生長期 10、12、14、16、18、20 h的種子液接種,測定酶活力和OD600。結果如圖4。結果表明,菌齡為對數生長 10～18 h的菌種發酵過程中,其生物量隨菌齡增大而增加,18 h達到最大,之后下降。而菌種酶活力最高的接種種齡為對數生長14 h的菌種,14 h后的菌種酶活力大大下降。選擇酶活力最高的菌種做種子液,據圖4結果,選擇最適接種齡為對數生長 14 h。

2.2.2 接種量對工程菌 pk53產酶的影響

圖4 接種齡對產酶和生長的影響

接種量對發酵產酶有一定的影響。接種量過大,培養基消耗快,在進入穩定期后反而不利于產物的合成。反之,接種量過小,菌體生長緩慢,導致發酵周期延長。本試驗種子液接種量分別為 0.5%、1%、1.5% 、2%、2.5%,測定酶活力和OD600,結果表明(圖5),隨接種量增大,菌濃度逐步提高,2%達到最高。但由酶活測定結果可見接種量為 1%時菌體酶活力最高,高于低于 1%接種量菌體酶活力均減少。因此確定 1%為最適接種量。

表1 L9(34)正交試驗表

表2 培養基成分的方差分析

圖5 接種量對產酶和生長的影響

2.2.3 甲醇添加量對工程菌 pk53產酶的影響

按搖瓶培養的方法每 24 h補加甲醇,添加量分別為 0.5%,1%,1.5%,2%,2.5%,測定酶活力和OD600。結果如圖6。在甲醇濃度為 0.5%～1.5%范圍時,菌體生物量和酶活力都在逐步增加,但甲醇添加量高于 1.5%時,菌體生物量和酶活力都在下降。甲醇是工程菌誘導產酶階段的唯一碳源和能源,如果其代謝消耗速率跟不上所加入的速率而在發酵液中累積時,會對菌體本身有傷害,限制菌體的生長,而且還會對酶的表達有抑制作用,導致酶活性下降[8]。所以確定甲醇添加量為 1.5%。

2.2.4 培養基 pH值對工程菌 pk53產酶的影響

2.2.4.1 生長階段初始 pH值對工程菌 pk53產酶的影響

調節生長培養基 pH值為 4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,測定酶活力和OD600。結果由圖7可知,pH值為 4.0～5.0時菌體生物量逐步增大,pH值為 5.0～6.5時菌體生物量變化不大,且 pH值為 5.5時菌體酶活力最高,所以確定最適初始 pH值為 5.5。

圖6 甲醇濃度對產酶和生長的影響

圖7 生長階段 pH對產酶和生長的影響圖

2.2.4.2 誘導階段初始 pH值對工程菌 pk53產酶的影響

調節誘導培養基 pH值為 4,4.5,5,5.5,6.0,6.5,測定酶活力和OD600。結果由圖8所示,隨 pH值的增加,越不利菌體生長,酶活力卻逐漸升高,pH為 6.0時產酶最高,當 pH高于 6.0時,隨 pH增加酶活逐漸下降。說明 pk53產酶量并不單純取決于生物量,還與單位菌體產酶量相關,通過誘導階段初始 pH的優化提高了 pk53產纖溶酶的比生產率。所以確定誘導階段初始 pH值為 6.0。

圖8 誘導階段 pH對產酶和生長的影響

2.2.5 裝液量對工程菌 PK53產酶的影響

通過改變裝液量控制溶氧,調整 250 mL三角瓶中裝液量分別為 20、30、40、50、60 mL測定酶活力和OD600,結果如圖9。

圖9 裝液量對產酶和生長的影響

結果表明,裝液量大于 30 mL時,酶活力隨著裝液量的增加而顯著下降;裝液量小于 30 mL時,酶活力也下降,生物量的變化與酶活力的變化呈正相關。說明生物量大小與溶氧對 pk53產酶影響是偶聯的,因此確定 30 mL/250 mL的裝液量為宜。

2.3 工程菌 pk53發酵過程曲線

在上述優化的發酵工藝條件下,連續誘導 144 h,每隔 24 h取樣測酶活。結果顯示 (圖10),隨著誘導時間的延長,發酵液的酶活力逐漸升高,96 h到達最高,上清的酶活力為 429.06 U/mL,隨后發酵液的酶活力下降,可能與衰老細胞釋放出的蛋白水解酶有關[10]。優化發酵條件前,誘導 120h達到最大酶活為48.31 U/mL,發酵活力提高了 8.88倍,產酶高峰提前 1 d。表明采用優化的工藝條件,不僅大大提高了發酵產量,且縮短了發酵周期。

圖10 纖溶酶 pk53發酵曲線

3 結論與討論

本試驗菌株 pk53遺傳表型Mut+,醇氧化酶啟動子 AOX1,載體 pPIC9K。其最佳培養基組成:麩皮1.5%,豆粕粉 2.0%,,KH2PO40.5%,MgSO4·7H2O 0.05%;最佳培養條件:接種齡 14 h,接種量 1%,甲醇添加量 1.5%,培養基裝液量 30 mL(250 mL三角瓶),生長 pH值 5.5,誘導 pH值 6.0。在此條件下培養,纖溶酶酶活力達 429.06 U/mL,是初始發酵條件下產酶活力的 8.88倍。

試驗發現促進產酶的主要影響因素為麩皮。麩皮中含有較豐富的酶系、蛋白質、碳水化合物、維生素和礦物質等[11],推測麩皮中可能存在某種“刺激因子”能夠促進畢赤酵母基因工程菌 PK53產纖溶酶。這一研究結果與劉明啟,孫建義等人[12]的報道一致,利用麩皮做碳源來促進外源目的蛋白的表達。

本試驗采用兩階段調控法研究了基因工程菌PK53在菌體生長和誘導表達階段的最適初始 pH值,研究發現菌體生長階段初始 pH值為 5.5,誘導產酶階段初始 pH值為 6.0時纖溶酶表達量顯著提高。國內也有類似報道,不同階段采用變 pH發酵,提高目的蛋白表達量[13-15]。發現甲醇畢赤酵母對溶解氧的需求很大,但也不是溶氧越高越好。試驗中裝液量20 mL反而比 30 mL產酶低,可能因為溶氧過多造成氧中毒[9],但氧氣不足則限制菌體生長,進行厭氧發酵產生乙醇且會積累甲醇。

畢赤酵母工程菌常規培養基為 BMGY與 BMMY,但成分復雜,價格較高[16]。目前,研究多集中在產植酸酶的酵母工程菌培養基的優化。李洪淼等人制成麥芽-麩皮培養基,用于培養植酸酶畢赤酵母工程菌 PP-NPm-8[17]。灑榮波等人制成葡萄糖、氨水培養基,用于培養植酸酶畢赤酵母工程菌 K M71[18]。本試驗研制的產纖溶酶畢赤酵母工程菌培養基在國內尚沒發現類似報道。培養基中的組分麩皮,豆粕粉具有來源廣,成本低的特點,更利于工業化生產。下一步我們將通過發酵罐培養對 pH、供氧等發酵條件進行控制和優化。

[1] 劉彩平,崔堂兵.產纖溶酶微生物的篩選鑒定及生長模型的建立[J].食品與發酵工業,2010,36(6):12-15.

[2] 李寶庫 ,周巖,靳玉卯,崔哲 .纖溶酶產生菌液體培養條件的研究[J].中國釀造,2008(14):29-31.

[3] Sreekrishna K,Brankamp R G,Kropp K E,et al.Strategies for optimal synthesis and secretion of heterologous p roteins in the methylotrophic yeastPichia pastoris[J]. Gene,1997,190(1):55-621.

[4] 戴秀玉,一種值得注意的基因表達系統 -巴斯德畢赤酵母[J].微生物學報,1997,36(7):483.

[5] 王海寬,路福平 .培養條件對甲醇畢赤酵母異源表達木質素過氧化物酶的影響[J].天津科技大學學報,2007,22(1):33-36.

[6] Klaus W(ed).Nonconventional Yeasts in Biotechnology[M].Berlin:Springer,1996:203-253.

[7] Hanxin-mian,Guo Run-fang.Cloning and expression of one fibrinolytic enzyme fromBacillussp.zlw～2[J].Agricultural Sciences in China.2009,8(5):591-596.

[8] 李洪淼,王紅寧 .畢赤酵母高密度發酵研究進展[J].生物技術通訊,2005,16(2):210-212.

[9] 林俊涵 .畢赤酵母高密度發酵工藝的研究[J].中國生物工程雜志,2009,29(5):120-125.

[10] 邱榮德,朱建蓓,王壘.人 p53蛋白在巴氏德畢赤酵母中的表達[J].生物工程學報 .1999.15(4):477-481.

[11] 郭禎祥,李利民,溫紀平 .小麥麩皮的開發與利用[J].糧食與飼料工業,2003(6):43-45.

[12] 劉明啟,孫建義 .重組畢赤酵母產木聚糖酶條件的優化[J].浙江大學學報,2006,32(2):222-226.

[13] 謝子文.工程菌產植酸酶搖瓶發酵條件初探[J].中國飼料,2007(3):13-16.

[14] 李洪淼,王紅寧 .重組巴斯德畢赤酵母高密度發酵表達植酸酶[J].中國生物工程雜志,2005,2(16):295-298.

[15] 姚鈺舜,儲炬,杭海峰 .培養條件對重組畢赤酵母高密度表達豬胰島素前體的影響 [J].華東理工大學學報:自然科學版,2006,32(4):397-401.

[16] 王平章 .植酸酶phyA基因轉化畢赤酵母的篩選及工程菌培養基研究[D].成都:四川農業大學學位論文,2002.

[17] 李洪淼 .植酸酶畢赤酵母基因工程菌發酵條件研究[D].成都:四川農業大學學位論文,2005.

[18] 灑榮波,石貴陽,王正祥 .基因工程菌Pichia pastoris高密度培養條件的搖瓶研究[J].食品研究與開發,26(2):52-56.