超高壓加工對(duì)食品酶催化特性的影響＊

張瑜,繆銘,江波,張濤

近年來,隨著社會(huì)的發(fā)展與科技的進(jìn)步,消費(fèi)者對(duì)現(xiàn)代食品的質(zhì)量與品質(zhì)要求越來越高。基于食品的安全、營養(yǎng)、健康等關(guān)鍵問題,現(xiàn)代食品制造技術(shù)逐漸從"熱"加工向"非熱"加工方向轉(zhuǎn)變。作為非熱加工技術(shù)領(lǐng)域的高技術(shù)之一,超高壓加工 (high pressure processing,HPP)技術(shù)是將食品密封在容器內(nèi),以水或油作為傳壓介質(zhì),在常溫或稍高于常溫 (25～60℃)下進(jìn)行 100～1 000 MPa的加壓處理,維持一定時(shí)間后不僅可以有效殺滅腐敗菌和致病菌等微生物,還可使食品酶、蛋白質(zhì)和淀粉等生物大分子改變活性、變性或糊化,從而最大限度保持或改善產(chǎn)品功能品質(zhì),是一種已被美國農(nóng)業(yè)部 -食品安全檢查服務(wù)部 (USDA-FSIS)認(rèn)證和消費(fèi)者接受的新型食品加工技術(shù)[1]。由于 HPP技術(shù)應(yīng)用于食品工業(yè)具有工藝簡(jiǎn)單、操作安全、節(jié)約能源、綠色安全等特點(diǎn),目前在日本、美國、歐洲等發(fā)達(dá)國家發(fā)展迅速,已經(jīng)有商業(yè)化的產(chǎn)品面市,例如日本越後制菓、美國 Avomex公司、Kraft食品公司、西班牙 Esp公司、法國 Pernod Ricard公司等已生產(chǎn)出最小加工、品質(zhì)新鮮、即食的HPP產(chǎn)品,主要有方便米飯、水果制品、奶制品、肉制品、海鮮產(chǎn)品等[2-3]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全球已有 56個(gè)國家采用超高壓技術(shù)加工食品,HPP食品超過了 13萬t。

目前,HPP技術(shù)主要作為新興技術(shù)應(yīng)用于酸性食品保藏,主要機(jī)理是能夠使微生物細(xì)胞膜和細(xì)胞壁損傷,改變細(xì)胞形態(tài),影響細(xì)胞內(nèi)酶活力及細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)和廢棄物的運(yùn)輸,從而殺死食品中的腐敗菌和致病菌。但是,HPP技術(shù)也能夠有效或部分鈍化食品中的內(nèi)源酶,同時(shí)可以激活常壓下惰性的食品酶,提高其活性和穩(wěn)定性,這對(duì)食品加工過程的催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)是有益的,比如 HPP技術(shù)可以加快某些在常壓下反應(yīng)緩慢甚至不進(jìn)行的酶促反應(yīng),生成高附加值產(chǎn)物,提高生產(chǎn)效率與食品品質(zhì)[4]。本文就 HPP技術(shù)對(duì)食品酶的影響機(jī)制及結(jié)構(gòu)變化作簡(jiǎn)單介紹,綜述近幾年國內(nèi)外該高新技術(shù)改變食品酶催化能力方面的最新研究進(jìn)展。

1 HPP影響食品酶活力的機(jī)理

1.1 壓力誘導(dǎo)穩(wěn)定性機(jī)制

在酶分子體系中,壓力和溫度對(duì)酶分子排列和空間構(gòu)象存在拮抗關(guān)系,使得二者關(guān)系圖呈橢圓形曲線,如圖1所示。

圖1 理論上壓力 -溫度對(duì)酶蛋白構(gòu)象的影響

未變性酶蛋白區(qū)域在橢圓形曲線內(nèi) (深色陰影),變性酶蛋白區(qū)域在橢圓形外,線的輪廓是可逆變性區(qū)(淺色陰影),即天然酶和變性酶的平衡濃度相等。不同加工條件下,加壓或升溫對(duì)酶的影響不同。在圖1中,A處 (低溫低壓)適度地增加溫度和壓力都能對(duì)酶起穩(wěn)定作用;D處 (高溫高壓)溫度和壓力任一增加都會(huì)破壞酶的穩(wěn)定;B處 (低溫高壓)增加壓力使酶變性,增加溫度能夠穩(wěn)定酶活,C處 (高溫低壓)與 B處壓力和溫度作用相反。Eisenmenger[4]等已經(jīng)報(bào)道壓力 -溫度處理呈橢圓形變性曲線的食品酶主要包括胰凝乳蛋白酶、多酚氧化酶、果膠甲酯酶 、芥子酶 、柚苷酶 、β-葡聚糖酶 、α-淀粉酶 、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶等。

Knorr等[5]對(duì)大麥芽中的 α-淀粉酶 、β-淀粉酶和β-葡聚糖酶和黑曲霉中的兩種葡糖淀粉酶同工酶GA1和 GA2在溫度和壓力下的變性曲線做了深入的研究 (圖2),得出這幾種酶都存在橢圓形的變性曲線,證實(shí)了壓力與溫度結(jié)合處理存在明顯的拮抗關(guān)系 。大約在 200 MPa(α-和 β-淀粉酶 )、400 MPa(β-葡聚糖酶和 GA2)和 600 MPa(GA1),酶明顯表現(xiàn)出對(duì)熱穩(wěn)定性。另外,從圖可以看出,淀粉酶的熱穩(wěn)定性與壓力穩(wěn)定性沒有直接聯(lián)系。例如,β-葡聚糖酶活性在室壓下溫度高于 50℃會(huì)快速失活,但是能在高于 800MPa下穩(wěn)定。相反,β-淀粉酶在 600MPa不穩(wěn)定,但是室壓下能夠承受高于 55℃的溫度,而沒有活性喪失。甚至是來源相同的同工酶 (GA1和 GA2)也表現(xiàn)出不同的物理穩(wěn)定性。

圖2 不同淀粉酶變性的壓力-溫度關(guān)系圖

1.2 壓力誘導(dǎo)活性機(jī)制

不同壓力作用于食品酶體系,可影響酶催化反應(yīng)速率,主要是因?yàn)槠?①對(duì)酶結(jié)構(gòu)的直接改變;②對(duì)反應(yīng)機(jī)制的改變,例如,對(duì)限速反應(yīng)階段的改變;③對(duì)底物和溶劑物理性質(zhì) (pH、密度、黏度、相)的改變能影響到酶的結(jié)構(gòu)或限速階段。壓力對(duì)酶的反應(yīng)速率的影響符合勒夏特列原理:提高壓力平衡將向體系總體積減小的方向移動(dòng)。壓力對(duì)反應(yīng)速率和平衡的影響可以由艾林 (Eyring)方程式評(píng)價(jià)[4]:

式中:P-壓力;T-絕對(duì)溫度;R-理想氣體常數(shù),△V≠-活化體積,k-速率常數(shù)。△V≠是活化態(tài)V≠和基態(tài)VA的差,由公式 (1)可知,當(dāng)系統(tǒng)的活化態(tài)體積小于基態(tài)體積 (△V≠為負(fù)值),反應(yīng)速率隨壓力的升高而增加,反之速率則降低。由于壓力影響酶的很多因素:例如酶的構(gòu)象、酶的溶劑化 (與周圍介質(zhì)、其他蛋白質(zhì)、水、離子等的相互作用)、化學(xué)平衡和固定化載體與酶結(jié)合的改變,所以酶與化學(xué)催化劑不同,其反應(yīng)的活化體積不是常數(shù)。一般酶反應(yīng)或其構(gòu)象變化下,活化體積范圍在 -70～+60 cm3/mol之間,大多數(shù)在 30 cm3/mol以下。Eisenmenger等[7]報(bào)道來源于南極假絲酵母的脂肪酶在 80℃、0.1～200 MPa下△V≠為負(fù)值,相應(yīng)的Vmax逐漸增加;300～500 MPa下為正值,相應(yīng)的Vmax逐漸降低。

2 HPP對(duì)食品酶空間結(jié)構(gòu)的影響

天然酶蛋白在物理或化學(xué)因素作用下,其特定的空間結(jié)構(gòu)被破壞,從而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性的喪失,但是其變性機(jī)理不同。溫度和化學(xué)變性劑主要引起整個(gè)酶蛋白共價(jià)鍵斷裂和分子的聚合而導(dǎo)致酶蛋白不可逆變性。而高壓變性機(jī)制則不同,它能使部分酶蛋白分子不變,在水溶液中共價(jià)鍵不受其影響。Knorr等[5]認(rèn)為壓力主要引起酶蛋白的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)變化。在較低壓力下二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋和β-折疊不被壓縮,甚至還會(huì)更加穩(wěn)定,但是在較高壓力 (高于 300～700 MPa)下,二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生不可逆變性 (見圖3)。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)是形成酶活性中心的基礎(chǔ),超高壓作用使三級(jí)結(jié)構(gòu)崩潰時(shí),酶活性中心氨基酸組成發(fā)生改變或喪失,從而改變酶催化活性。四級(jí)結(jié)構(gòu)是由非共價(jià)作用保持穩(wěn)定的,在高壓下會(huì)發(fā)生聚合。

圖3 超高壓導(dǎo)致酶蛋白結(jié)構(gòu)變化示意圖

壓力在 100～300 MPa之間 HPP處理也可以提高酶活,因?yàn)樵谕暾M織中酶和底物經(jīng)常被膜隔離,使用較低的高壓可以破壞這種膜,使酶和底物相互接觸,從而引起酶促反應(yīng)發(fā)生。HPP提高酶活的原因主要有以下 3方面:①超高壓處理使酶分子構(gòu)象發(fā)生限制性改變,利于酶與底物接觸;②超高壓使酶的部分活性部位裸露,使活性上升;③超高壓處理使酶分子轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写呋钚缘拿浮?/p>

高壓處理也會(huì)影響同工酶的數(shù)量和活性。Fang等[6]研究發(fā)現(xiàn),HPP處理獼猴桃果汁后,過氧化物酶在較低壓力下活性上升,并出現(xiàn)新的同工酶,在較高壓力下時(shí),新酶帶消失,活性有所抑制。采用圓二色譜觀察得到的兩種同工酶,發(fā)現(xiàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元含量不盡相同,在經(jīng)過 HPP處理后發(fā)生不同的變化,說明兩者的高壓穩(wěn)定性不同,這為兩者結(jié)合表現(xiàn)出的過氧化物酶活力在高壓下的不規(guī)律變化提供了新的依據(jù)。另外,有報(bào)道認(rèn)為具有壓力穩(wěn)定性的同工酶的存在是決定殘留酶活性的重要因素。

3 HPP對(duì)食品酶催化能力的影響

各種酶類經(jīng)超高壓處理后,能在較低的壓力下使其活力增強(qiáng),而在更高的壓力下,活性受到抑制而減弱。根據(jù)壓力對(duì)酶活的調(diào)節(jié)作用,可以選擇性的對(duì)食品酶催化特性進(jìn)行改變,使其適應(yīng)食品加工的需要。對(duì)食品有利的酶,可以通過調(diào)節(jié)壓力使其穩(wěn)定性和活性增強(qiáng),用于催化合成功能配料、風(fēng)味或色素等,能更有效的應(yīng)用于食品加工;對(duì)食品品質(zhì)有負(fù)作用的酶,可以通過控制壓力使其鈍化而保護(hù)食品質(zhì)構(gòu)及感官特性。

近幾年超高壓對(duì)食品酶活力的影響見表1。

表1 超高壓對(duì)酶活的影響變化

3.1 激酶效應(yīng)

HPP加工可以實(shí)現(xiàn)在適度的壓力下提高酶活,提高所需產(chǎn)物的反應(yīng)速率,為食品加工創(chuàng)造了很好的條件。

在功能性配料制備中,HPP對(duì)功能性多肽、柚皮素等的生成都有促進(jìn)作用。抗 ACE活性肽研究最多,其對(duì)治療高血壓有效。Quiros等[26]先確定卵清蛋白水解物中的活性肽序列,再研究使用超高壓提高生物活性肽釋放的可能性。在 400MPa下,分別使用胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶處理卵清蛋白,水解程度得到提高并改變了蛋白質(zhì)水解方式。在200～400 MPa下加速了抗 ACE活性肽的釋放,并論證了體外的降壓效果。由于柚皮素具有抗氧化、抗炎、抗癌、降壓降脂等功效,Helder等[15]研究了高壓對(duì)固定化柚皮苷酶催化水解柚苷生成柚皮素反應(yīng)的作用。海藻酸鈣微球包裹的柚苷酶在 160 MPa、35～40℃有較高的活性,固定化柚苷酶符合米氏動(dòng)力學(xué),160 MPa下,最大初始速率Vmax比常壓下高 65%,Km低 70%,高壓作用加快了酶轉(zhuǎn)化反應(yīng),促進(jìn)柚皮素的生成。

在淀粉糖生產(chǎn)中,HPP可以促進(jìn)β-淀粉酶水解淀粉的α-1,4-糖苷鍵生成麥芽糖。Heinz等[9]提出大麥芽中的β-淀粉酶受高壓和溫度影響較大,在 100 MPa、62℃下,處理 15 min能達(dá)到淀粉的最高解聚速度,比常壓下最佳條件 (55℃)的產(chǎn)量多 15%。超高壓也可以促使β-葡糖苷酶催化糖苷鍵的水解釋放β-D-葡萄糖和相關(guān)的糖苷配基,例如β-葡糖苷酶的催化特性在壓力和溫度分別為 55～65℃、0.1～100 MPa條件下有協(xié)同效應(yīng)。

在冷飲和焙烤工業(yè)中,HPP可以促進(jìn)脂肪酶催化酯交換反應(yīng),以改變脂肪的晶型和溶解特性,提高產(chǎn)品的物理、感官和保健特性。Osorio等[25]研究了在無溶劑介質(zhì)中,高壓對(duì)綿毛嗜熱絲孢菌的固定化脂肪酶催化脂肪混合物的酯交換動(dòng)力學(xué)的作用。反應(yīng)物質(zhì)為棕櫚硬脂酸、棕櫚果油和富含ω-3多不飽和脂肪酸的甘油三酯,脂肪酶催化酯交換在 150MPa下活性較高,應(yīng)用 HPP可以使脂肪酶的選擇性向著有利的方向改變。

在合成香精香料方面,HPP可以促使脂肪酶催化產(chǎn)生酯類物質(zhì)。Eisenmenger等[7]研究了高壓下正己烷體系中固定化脂肪酶催化合成乙酸異戊酯的動(dòng)力學(xué)。與低壓下反應(yīng)相比,高壓 400MPa、80℃、4h能提高酶活 152%。當(dāng)溫度從 40℃升到 80℃,低壓下酶活增加 110%,而在 350 MPa下增加了 239%。超高壓使得反應(yīng)向產(chǎn)物方向移動(dòng),且反應(yīng)速率增快。因此,在生產(chǎn)乙酸異戊酯時(shí)選擇合適的壓力和溫度,會(huì)使生產(chǎn)效率大幅增加。

乳制品行業(yè)中,HPP促使β-半乳糖苷酶水解乳糖成半乳糖和葡萄糖。Degraeve等[11]研究了超高壓能夠提高米曲霉和大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的活性,并采用傅里葉變換紅外光譜 (FT-I R)觀察壓力和溫度對(duì)兩種酶結(jié)構(gòu)的影響變化。兩種β-半乳糖苷酶在 27℃、1h、低于 300 MPa的條件下酶活沒有明顯的損失。米曲霉的β-半乳糖苷酶比大腸桿菌的要穩(wěn)定一些,1h內(nèi) 50%的初酶活損失,前者需要 450 MPa,而后者則需要 400 MPa。

3.2 鈍酶效應(yīng)

HPP在食品冷加工處理上作用很大,可用于食品的殺菌滅酶,但不會(huì)破壞食品的色、香、味等風(fēng)味物質(zhì),處理后食品能保留原有生鮮風(fēng)味和營養(yǎng)成分。

果蔬加工中,HPP可以抑制多酚氧化酶 (PPO)引起的褐變和過氧化物酶 (POD)及脂肪氧合酶 (LOX)形成的不良風(fēng)味。Phunchaisri[27]研究發(fā)現(xiàn)高壓對(duì)荔枝品質(zhì)影響較小,200 MPa時(shí) POD酶活增加,在 600 MPa、60℃條件下,處理 20 min能使新鮮荔枝的 POD降低 50%,而 PPO降低 90%。但超高壓處理荔枝濃漿酶活變化就不明顯,這是歸因于漿液的氣壓保護(hù)效應(yīng)。Terefe等[19]通過研究熱和高壓對(duì)兩種草莓醬中的 PPO和 POD的滅活動(dòng)力學(xué),發(fā)現(xiàn)這兩種果醬的PPO極耐熱,在 100℃處理 30 min沒有明顯的鈍化作用,在 690 MPa,90℃條件下,PPO滅活量為 23%;POD則表現(xiàn)出高熱敏性,在 70℃下不到 5 min就完全失活。Rodrigo[23]研究了番茄汁的 LOX在溫度為 25～90℃、壓力在 100～650 MPa之間的穩(wěn)定性,得出低于 400 MPa LOX的活力比常壓下的高,說明壓力使LOX更利于與膜結(jié)合,利于酶解。在 650 MPa、60℃的條件下,處理 12 min番茄汁的 LOX的殘余酶活為20%。因此在果蔬加工中應(yīng)該有效控制壓力與溫度,抑制不利酶反應(yīng)形成褐色物質(zhì)或異味。

啤酒與果汁生產(chǎn)中,蛋白酶可作為啤酒澄清劑,HPP可以在澄清后將其滅活卻不影響食品品質(zhì)。Katsaros等[17]分別采取熱處理 (50～80℃,常壓)和高壓 /熱處理 (50～80℃,500～900 MPa)研究了木瓜蛋白酶和無花果蛋白酶的鈍化動(dòng)力學(xué)。當(dāng)固定加工溫度,增加壓力將增加滅活速率,在 900 MPa、80℃條件下,處理 22 min木瓜蛋白酶可達(dá)到 95%的滅活率。獼猴桃蛋白酶作為一種新型巰基蛋白酶,Katsaros[18]報(bào)道在 650 MPa下,處理大約 25 min獼猴桃蛋白酶的滅活率為 90%。

4 展望

HPP憑借著其在食品加工中不破壞食品營養(yǎng)與功能、節(jié)能環(huán)保、處理時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),在熱敏性食品的殺菌、鈍酶、保持食品新鮮度等方面有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α５?HPP在國內(nèi)研究應(yīng)用還相對(duì)滯后,需要在非熱殺菌動(dòng)力學(xué)與機(jī)理、食品品質(zhì)影響與動(dòng)力學(xué)分析、安全性評(píng)價(jià)、工程裝備及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用等方面不斷拓寬和深入,尤其是 HPP對(duì)食品酶穩(wěn)定、激活或鈍化動(dòng)力學(xué)及機(jī)理模型。隨著 HPP在我國得到深入理論研究及廣泛產(chǎn)業(yè)應(yīng)用,會(huì)進(jìn)一步推動(dòng)我國超高壓食品加工業(yè)發(fā)展,并滿足消費(fèi)者對(duì)高品質(zhì)健康食品的需求。

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