蘋果中正己醇降解酶的提取＊

朱靜,師俊玲,劉延琳

正己醇是食品加工,特別是酒類釀造中經常產生的一種雜醇油類高級醇[1],具有強烈的刺激性氣味,對食品風味有不良影響。過多地攝入會使人的神經系統充血,引起頭痛,具有一定的生理毒性[2-3],即人們常說的白酒上頭的原因[4-5]。另外,正己醇也是引起大豆豆腥味的主要成分之一[6-7]。近年來,隨著人們對正己醇危害性認識程度的加深,以及檢測技術的發展和檢測靈敏度的提高,人們對正己醇的生理毒害的重視程度也越來越高。適當降低產品中正己醇含量對提高食品質量和安全性有重要意義。

目前,正己醇的轉化主要是化學方法,如將正己醇轉化為正己醛[8～10]或己酸己酯[11]。但是,化學催化會引入新的不安全因素,不適用于食品加工。酶法轉化則因其具有催化效率高、安全、對環境友好等優點在食品加工方面有很好的推廣應用前景。已有研究顯示,正己醇大量地存在于各種植物組織中,呈現青草氣息的水果味,是蘋果鮮果和蘋果汁中香氣成分的重要組分之一[12-14]。植物體內正己醇主要由氨基酸的分解代謝或脂肪酸的合成代謝而產生[15-16]。蘋果中的正己醇主要來自于果實發育過程中的脂肪氧化酶和醇脫氫酶對脂肪酸的β氧化作用[16]。Kim和Grosch[17]研究發現,蘋果中的脂肪氧化酶 (LOX)能形成氫過氧化物,對蘋果中正己醇和正己醛的生成有重要作用;正己醛則在蘋果醇脫氫酶 (ADH)的作用下生成正己醇,因而成熟的蘋果中同時存在正己醛和正己醇[18-19]。由此推測,如果上述反應為可逆反應,則在蘋果體內必然存在將正己醇轉化為正己醛或其它物質的酶系。為此,利用蘋果體內的酶系降低正己醇含量的生物轉化是有可能的。我們的前期研究也證明了蘋果中的確存在能夠降低正己醇的酶系,并對其作用的最適 pH和最適溫度有了初步了解。本文擬在前期研究的基礎上,旨在為蘋果中的正己醇降解酶尋求較好的制備方法,并進行初步純化的探索,為其進一步應用提供基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

蘋果:市售成熟的紅富士蘋果,無傷痕、無病害、品質良好,購于陜西楊凌水果市場。

主要試劑:正己醇,色譜純,國藥集團化學試劑有限公司進口分裝;丙酮、檸檬酸、檸檬酸鈉、三氯乙酸(TCA)、聚乙烯聚吡咯烷酮 (PVPP)、聚乙二醇辛基苯基醚 (TritonX-100)、十二烷基硫酸鈉 (SDS)、過硫酸銨 (AP)均為國產分析純;考馬斯亮藍 G-250、考馬斯亮藍 R-250、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)、四甲基乙二胺 (TEMED)、甘氨酸、牛血清白蛋白,為優級純。

1.2 儀器與設備

HZS-H水浴振蕩器,哈爾濱市東明醫療儀器廠;GC9800(FP)氣相色譜儀,上海科創色譜儀器有限公司;丹佛 T-203型電子天平,北京賽多利斯儀器系統有限公司;ST-303織勻漿器,廣東美斯特電器;F-101電動攪拌器,鞏義市英峪予華儀器廠;GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機,海安亭科學儀器廠;UB721紫外分光光度計,日本島津;DYCZ-22A型電泳槽,北京六一儀器廠。

1.3 粗酶的提取方法

將多個同一品種蘋果 (4℃預冷 2 d)果皮部分(厚度 0.4～0.5 mm)混勻之后,及時稱取 200 g,按照以下幾種方法分別處理,所得粗酶液均定容至 100 mL,冷藏備用。

緩沖體系:0.1 mol/L的 4℃預冷的 pH值 4.6的檸檬酸 /檸檬酸鈉緩沖溶液。

(1)緩沖溶液提取法:稱取上述蘋果果皮 200 g,溶解于 100 mL上述緩沖體系,用組織勻漿器打碎,勻漿液超聲波破碎 20 min(冰浴),破碎功率固定為 20 kHz、20 W,再用 4層干凈紗布過濾,取濾液在 4℃下4 000 r/min離心 30 min,取上清液冷藏于 4℃冰箱,備用。

(2)丙酮粉提取法[20]:在 200 g上述蘋果果皮中加入 50 mL冷凍丙酮 (-30℃),在高速組織勻漿機中打漿,將果漿轉入燒杯中,加入 100 mL冷凍丙酮,用玻璃棒緩慢攪拌 1 min,用真空泵抽濾,濾渣再用100 mL冷凍丙酮溶解,經玻璃棒攪拌均勻后,再次抽濾。如此反復,直至濾渣為無色為止,濾渣轉入真空干燥器至干,即得粗酶粉。將上述粗酶粉溶解于 100 mL上述緩沖體系中,在 4℃下用電子恒速攪拌器緩慢攪拌 30 min,再用 4層干凈紗布過濾,取濾液在 4℃下 4 000 r/min離心 30 min,取上清液冷藏于 -40℃冰箱,備用。

(3)TritonX-100提取法[21]:同 (1)但緩沖體系中含 1%的 TritonX-100。

(4)TritonX-100+PVPP提取法[22]:同 (1)但緩沖體系中含 1%的 PVPP和 TritonX-100。

1.4 正己醇降解能力的測定

1.4.1 反應體系

正己醇濃度為 1.3 g/L的 10 mL檸檬酸 /檸檬酸鈉緩沖液 (pH 4.6,濃度 0.1 mol/L),酶液用量 2 mL。

1.4.2 實驗方法

測定粗酶液的正己醇降解能力時,直接在 1.4.1反應體系中加入 2 mL粗酶液進行反應,對照均為:用2 mL上述緩沖體系代替酶液的反應體系。反應條件:37℃、100 r/min水浴,反應 4 h。反應結束后,及時取樣,立即冰浴后置于 4℃下貯存,用于測定正己醇殘留量。每種體系進行 3個平行試驗。

1.5 提酶方式及初步純化對正己醇的酶促降解影響

1.5.1 提取方式對酶活力影響

在 1.4.1反應體系中加 1.3中 (1)、(2)、(3)和(4)提取粗酶液各 2 mL,按 1.4.2中實驗方法測定正己醇降解能力。

1.5.2 純化方法對酶活力影響

取 2 mL粗酶液,分別加入 (NH4)2SO4使飽和度達到 70%,4℃靜置過夜,10 000 r/min離心 30 min,沉淀溶于 pH值 4.6,0.1 mol/L檸檬酸緩沖液,經同樣緩沖液透析,按 1.7.3和 1.4.2的方法測定蛋白質含量和正己醇的降解能力。

1.5.3 蛋白質分子量及蛋白質濃度的測定 (SDSPAGE電泳)

參考 Laemmli[23]的方法進行。對采用 4種方法提取的酶及其 70%(NH4)2SO4鹽析、透析處理的樣品進行電泳分析[24]。聚丙烯酰胺凝膠組成為 4%(w/v)丙烯酰胺 (濃縮膠)和 12%(w/v)丙烯酰胺 (分離膠),進樣量為 20μL。電泳所用電流,濃縮膠 20 mA、分離膠 15 mA。剝膠后用 120 g/L TCA浸泡 10 min,固定蛋白質樣品。染色過夜后進行脫色處理,脫色完畢后用寶生物 (Bio-rad)呈像系統分析。

1.6 酶的初步純化(丙酮粉法提酶)

1.6.1 (NH4)2SO4鹽析分離最適飽和度的確定

提取的酶液參考謝棟[25]的方法,確定最適(NH4)2SO4飽和度。取 9個離心管,各加粗酶液 2 mL,分別加入 (NH4)2SO4使飽和度達到 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%和 100%,4℃靜置過夜,10 000 r/min離心 30 min,沉淀溶于 pH值 5.4,0.1 mol/L檸檬酸緩沖液,經同樣緩沖液透析,用聚乙二醇 6 000濃縮,測定每管的蛋白質含量和正己醇的降解能力。

1.6.2 (NH4)2SO4鹽析分級沉淀

邊攪拌邊緩慢在粗酶液中加固體 (NH4)2SO4至30%飽和度,4℃靜置 8 h,10 000 r/min離心 10 min,棄沉淀,上清液中再加固體 (NH4)2SO4至 70%飽和度,4℃靜置 8 h后 10 000 r/min離心 10 min,同

1.6.1 處理。

1.7 指標檢測

1.7.1 正己醇含量的測定

反應結束后的待測樣,用氣相色譜儀 (GC9800/FI D)按照頂空進樣法檢測正己醇殘留量[26],以體積分數 5%4-甲基-2-戊醇的丙酮溶液作內標。

氣相檢測用色譜柱為彈性石英毛細管柱 DBWAX-10(Φ0.53 m ×30 m),載氣 N2,進樣量 300μL,采取程序升溫,即第 1階段初始溫度 55℃,初溫保持時間 3 min,升溫速率:15℃/min,終止溫度 200℃,終溫保持時間 3 min;第 2階段,初始溫度 0℃,升溫速率 0℃/min,終止溫度 0℃。

1.7.2 正己醇降解率的計算

通過內標法獲得對照和樣品中正己醇的保留時間和峰面積,以與每個處理相應的對照為基準,計算正己醇降解率。

式中,A0為對照的正己醇峰面積;A1為加酶后正己醇峰面積。

1.7.3 蛋白質含量檢測

[26]所述方法,采用考馬斯亮藍 G-250法檢測粗酶液中蛋白質含量。

1.7.4 單位蛋白質正己醇降解量

1.7.5 酶的純化倍數

2 結果與分析

2.1 提酶方式及初步純化對正己醇的酶促降解影響

Prisky等研究發現,在非離子洗滌劑 Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)存在的情況下,蘋果中的Lox酶的活性減小,說明蘋果中的 Lox酶可能與細胞膜有關,需采用丙酮等有機溶劑或加入表面活性劑處理的方法提取。而大多數蛋白質均可溶于水、稀鹽等溶液中,因此考慮用不同的溶劑提取酶。

圖1顯示了用 4種不同溶劑進行提取所得粗酶液及其純化后蛋白的正己醇降解能力。結果顯示,方法 (3)和 (4)的提取緩沖液中加入 TritonX-100或PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮),所得酶液的活性均有顯著提高。這是因為 TritonX-100和 PVPP屬于非離子型表面活性劑,能夠破壞細胞膜的脂膜結構,從而利于膜上酶蛋白的釋放。而作為非離子型溶液,丙酮提取所得酶液的活性也比較高,而且在鹽析后,其活性遠遠高于用緩沖液體系提取所得酶液,可能是丙酮為有機溶劑也利于膜上蛋白的釋放,提取過程中去除了抑制酶活的糖份 (總糖去除率為 81.98%)或鹽析和透析過程中去除了粗酶中抑制因子的原因。

提取所得粗酶液中還含有其它雜質,特別是糖份。這些物質的存在都會給后續的分離純化帶來困難。因此,粗提液中的雜質含量越少越好。在此,重點考察了提取液的含糖量。由圖2可以看出,丙酮法所得酶液中糖含量遠遠低于緩沖液提取體系。這是因為丙酮在提取的過程中還有除糖、脫色、脫脂等作用。

圖1 不同提取方法所得粗酶液的正己醇降解能力

圖2 不同提取方法所得酶液中的總糖含量

不同提取方法所得酶液的特性對比見表1。可以看出,丙酮法所得粗酶液的總正己醇降解活性較差,但其單位酶活很高,是含 TritonX-100,PVPP緩沖液的 1.10～1.87倍。且丙酮粉法所得酶量較少,僅為 5.0 g(200 g蘋果提取)左右。這與李立祥等研究結果類似[28]。考慮到正己醇降解酶的應用,所得酶制劑不僅要考慮酶活性,更要著眼酶制劑本身的活性、體積和應用性。曲拉通法和曲拉通 +PVPP法所得粗酶液的活性雖然略高,但酶液體積大,不易貯存,尚需進行濃縮、提純才能達到應用要求,不利于酶的應用。相對而言,丙酮粉法雖對正己醇降解酶活性有所損失,但純化倍數最高,加上其酶粉本身活性尚可、體積小和便于貯存、可以直接應用,因此在應用上具有優勢。

提取方法 (2)、(3)和 (4)純化倍數分別為 1.12、0.90、0.61,丙酮粉法提取的酶液在經過鹽析和透析處理后的酶活性增加幅度最大 (增加 49.28%)。這與馬歇克的研究結果相同[29]。即,在純化的初始階段,酶的總活性表現為有所增加。這是因為鹽析和透析過程中除去了存在于初始提取物中的抑制因子,或者由于樣品中的物質種類繁多而使活性未能呈現出量的線性依賴性。

表1 不同提取方法所得酶液的特性

丙酮粉法所得粗酶的蛋白含量低于含 TritonX-100,PVPP緩沖體系,但經過初步純化后,其正己醇降解酶活力最大,且純化后蛋白含量明顯高于純化前。這說明,用含 TritonX-100,PVPP緩沖液體系所得酶液中多出的蛋白主要是雜蛋白,而不是酶蛋白。

綜合考慮,確定丙酮粉法用于蘋果中正己醇降解酶的提取。

2.2 蛋白質分子量及蛋白濃度的測定(SDS-PAGE電泳)

要分離純化未知酶系,首先要確定目標酶的分子量等基本特性。在此,主要考察了粗酶中總蛋白的特性,而且側重分析了丙酮法所得粗酶液中的蛋白分布。由粗酶的全蛋白電泳圖譜 (圖2)可以看出,丙酮粉法有 10個條帶,蛋白分子量分布范圍較寬,且條帶顏色較深,說明蛋白含量較高;其它 2種方法所得粗酶中只有 3條帶,蛋白分子量范圍較窄,且條帶顏色較淺,說明蛋白含量較少。由此推測,正己醇降解酶可能與細胞粒上的脂類物質結合較緊,需采用丙酮等有機溶劑的方法提取。

圖2 不同提酶方法及部分純化后蛋白的 SDS-PAGE

總體來看,小分子蛋白顏色深,含量較高,而大分子蛋白顏色較淺,含量較少。

經過硫酸銨處理過的酶液條帶顏色上有所增加,尤其是加入 TritonX-100的方法,經過處理后條帶數量和顏色均有所增加。據陳惠等研究[27]可知,硫酸銨對酶有顯著的保護作用,鹽的添加能顯著改善酶的熱穩定性。因為鹽類有離子鍵作用,當酶的活性中心含有離子作為配位體時,鹽離子就能穩定酶的構象。另外,鹽作為水分子的替代物占據水的位置,排除自由水對酶造成的不穩定化影響。但曲拉通 +PVPP法處理后卻減少了,具體的原因還需進一步研究。

2.3 酶的初步純化

2.3.1 丙酮粉法提酶 (NH4)2SO4鹽析分離最適飽和度的確定

一般粗抽提物經常利用鹽析法進行粗分。硫酸銨沉淀常用作實驗室蛋白純化的第一步,它可以初步粗提蛋白質,去除非蛋白成分。蛋白質在硫酸銨沉淀中較穩定,可以短期在這種狀態下保存中間產物,當前蛋白質純化多采用這種方法進行粗分離。

由圖3可見,隨著硫酸銨飽和度的增加,所得蛋白的沉淀量和沉淀物的酶活均呈先上升后下降的趨勢,并分別在硫酸銨飽和度 60%和 70%時達到最大值。硫酸銨飽和度小于 30%時,蛋白沉淀量和沉淀物的酶活都很低。硫酸銨飽和度為 60%時所得蛋白質的沉淀量雖然最大,但其酶活并未達最大值,說明此時沉淀下來的蛋白質主要是雜蛋白。綜合考慮,選用硫酸銨飽和度為 30%～70%。

圖3 (NH4)2SO4飽和度與蛋白析出量、酶活的關系

2.3.2 丙酮粉法提酶 (NH4)2SO4鹽析分級沉淀

對粗酶提取液進行分級沉淀,結果發現分級沉淀所得蛋白的正己醇降解率為 88.56% ±0.985%,說明條件選擇合適。

3 討論與結論

3.1 討論

(1)通過酶法轉化降解正己醇含量具有專一性強、無毒副作用、對環境友好等優點,在提高食品質量與安全性,以及對于正己醇高污染區的環境修復等方面都有重要意義。蘋果中正己醇降解酶是其本身產生的酶類,蘋果是人們日常食用的水果。從中提取的酶類是天然的、安全的,在食品加工中具有很好的應用潛力。本文確定了蘋果中正己醇降解酶的最適提取方法,并對粗酶的初步純化進行探討,為進一步研究提供了重要依據。

(2)生物轉化法降低正己醇是一個較新的課題,其中的作用機制、內在機理尚不清楚。雖然已有研究發現,植物體內的正己醇可在脂肪氧化酶 (LOX)的作用下轉化為正己醛[30],在乙酸的參與下經醇酰基轉移酶 (AAT)轉化為乙酸己酯或丁酸己酯[31],在脫氫酶 (ADH)的作用下生成己醛[32],但有關蘋果中酶系對正己醇的體外轉化作用的研究還未見報道。本文的研究也只是處于研究的最初階段,更深層的理論還有待進一步研究。

(3)蘋果中正己醇降解酶的作用效果有望得到進一步提高。目前,人們對于正己醇在蘋果內的代謝途徑已經有了比較透徹的了解。參考這些代謝途徑,可望在改變反應條件和酶的性質研究等方面獲得較大突破。由此,將有望進一步提高降解酶的作用效果。

3.2 結論

采用不同方法從蘋果中提取正己醇降解酶,優選最適的提酶方式,并研究了最適提酶方式下提取酶初步分離純化。結果顯示:采用丙酮粉法提酶較適合,且 SDS-PAGE電泳結果表明粗酶液和經硫酸鹽處理后的條帶分布有所變化。30%～70%為最適的(NH4)2SO4鹽析濃度,然后對酶液進行梯度鹽析,正己醇降解率為 88.56% ±0.9847%。

參考文獻

[1] 張躍廷,劉瓊,王佐民.淺談雜醇油 [J].釀酒,2002,29(5):18-20.

[2] PerbelliniL,D De Grandis,Semenzato F,et al.An experimental study on the neurotoxicity of n-hexane metabolites:Hexanol-1 and hexanol-2[J].Toxicology andApplied Pharmacology,1978,46(2):421-427.

[3] Gauke Veenstra,CatherineWebb,Hans Sanderson,et al.Human Health Risk Assess ment of Long Chain Alcohols[J].Ecotox Environ Safe,2009,72(4):1 016-1 030.

[4] 周新虎,崔如生.引起白酒口干、上頭問題的初探[J].釀酒科技,2001,(5):44～45.

[5] 張躍廷,劉瓊,王佐民.淺談雜油醇 [J].釀酒,2002,29(5):18-20.

[6] 謝繼志,肖麗霞,夏玉雷,等.脫腥方法對豆漿中正己醛和正己醇含量的影響[J].江蘇農學院學報,1996,17(1):155-173.

[7] 徐敬華,高保軍,賈振寶.豆制品中豆腥味的產生原理及消除方法[J].中國乳品工業,2002,30(5):78-80.

[8] 周廣棟,郭曉紅,劉延.正己醇氧化生成正己醛磷鎢雜多酸催化劑的過氧化氫分解活性[J].分子催化,2001,15(4):267-272.

[9] 周廣棟,郭曉紅,呂學舉.氧化鎂負載鉬釩磷酸銅催化劑上正己醇氧化脫氫制正己醛 [J].催化學報,2005,26(5)::389～392.

[10] 王磊,程鐵欣,周廣棟.正己醇 (氧化)脫氫制正己醛的研究[J].分子催化,2003,17(6):434-438.

[11] 何建英,劉素環,陳丹紅.己酸己醋的催化合成 [J].企業科技與發展,2007(17):47-48.

[12] 史清龍,樊明濤,閆梅梅,等.陜西主栽蘋果品種間香氣成分的氣相色譜 /質譜分析[J].釀酒,2005,32(5):66-69.

[13] 王海波,陳學森,辛培剛,等.幾個早熟蘋果品種香氣成分的 GC-MS分析[J].果樹學報,2007,24(1):11-15.

[14] 張建軍.蘋果汁芳香物質的研究——傳統蒸發、精餾工藝回收蘋果汁中芳香物質[J].食品與發酵工業,1995,21(2):9-16.

[15] Rowan D D,Allen J M,Fielder S,et al.Biosynthesis of straight-chain ester volatiles in red dlicious and granny s mith apples using deuterium-labeled precursors[J].Agric Food Chem,1999,47:2 553-2 562.

[16] 孫愛東.蘋果汁加工中典型芳香成分的形態、變化及香氣調控的研究[D].山東:山東農業大學博士后學位論文,2002:9-16.

[17] Ki m I S,Grosch W.Partial purification of a lipoxygenase from apple[J].Agric Food Chem,1979,27:243-246.

[18] 史清龍,樊明濤,閆梅梅,等 .陜西主栽蘋果品種間香氣成分的氣相色譜 /質譜分析 [J].釀酒,2005,32(5):66-69.

[19] 王海波,陳學森,辛培剛,等 .幾個早熟蘋果品種香氣成分的 GC-MS分析[J].果樹學報,2007,24(1):11-15.

[20] 田玉庭.源于澳洲青蘋果的多酚氧化酶 (PPO)特性及阻氧抑制技術研究[D].陜西:西北農林科技大學碩士學位論文,2006:23-24.

[21] 王輝龍,孫永峰,陳淑玲,等.番茄果汁中脂肪氧化酶的分離純化及β-過氧化物亞油酸的制備 [J].食品科學,2004,25(12):97-100.

[22] 郝慧英,趙光鰲,徐巖,等 .蘋果中多酚氧化酶的性質[J].無錫輕工學報,2003,22(1):7-8.

[23] LaemmliU.K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227:680-685.

[24] Krisztina Takács, éva Gelencsér,Elisabeth T,Kovács.Effect of transglutaminase on the quality of wheat-based pasta products[J].European Food Research and Technology,2008,226:603-611.

[25] 謝棟,彭憬,王津紅.枯草芽孢桿菌抗菌蛋白 X9811Ⅰ的純化與性質[J].微生物學報,1998,38(1):13-19.

[26] 令楨民,師俊玲,楊保偉.正己醇降解菌的分離、篩選及分類鑒定[J].菌物學報,2009,28(6):769-775.

[26] 楊玉芳.蛋白質含量測定方法[J].明膠科學與技術,2007,27(2):98-101.

[27] 陳惠,王紅寧.在糖及硫酸銨對植酸酶熱穩定性的影響[J].中國飼料,2004(18):22-23

[28] 李立祥,吳紅梅.提取方法對茶多酚氧化酶活性的影響[J].生化 .檢驗中國茶葉加工,2001(4):26～31.

[29] D.R.馬歇克等.蛋白質純化與鑒定實驗指南[M].北京:朱厚礎,2002:13～16

[30] Pinsky A S,Gross man,Trop M.Lipoxygenase contenttand antioxidant activity of some fruit and vegetables[J].Food Chemistry,1971,36:571-572.

[31] 李大鵬.蘋果醇酰基轉移酶基因MdAAT2參與酯類香氣合成調控機理的研究[D].山東:山東農業大學博士學位論文,2005.

[32] Sanz C,OliasJM,PerezA G.Aor ma biochemistryof fiuits and vegetables. Phytochemistry of Fruit and Vegetables.In F.A.Tomes-Barberan,RJ Robins,eds,PHytochermistry of fruits and vegetables[M].NewYork:Oxford University Press,1997:125-155.