噴施草甘膦對大豆表皮細胞超微結構影響的研究

卜貴軍

(1.湖北省生物資源保護與利用重點實驗室(湖北民族學院)，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學院 生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000)

草甘膦是內吸的，無選擇性的除草劑.草甘膦可以通過抑制莽草酸途徑，來抑制芳香族氨基酸的合成，從而除掉雜草.但由于它是非選擇性的，在除掉雜草的同時，如果遇到綠色作物，也會對其造成傷害.隨著生物技術的發展，一批抗草甘膦轉基因作物[1-2]的出現，使問題得到解決.而轉基因大豆中主要是抗除草劑草甘膦轉基因大豆[3-7]，到2007年已占到全球大豆的64%[8].

抗草甘膦大豆通過轉入CP4-EPSPS，使得大都對草甘膦不敏感，這樣芳香族氨基酸能夠繼續合成，大豆生長發育能正常進行.

種植抗草甘膦大豆就需要配套的使用大量的草甘膦以除去雜草.草甘膦市場越來越大.重新認識草甘膦對抗草甘膦植物和普通植物的傷害就變得非常必要.

Delannay X等[9]的研究表明，對抗草甘膦大豆噴施草甘膦對株型的快速生長無影響，不會導致顯著的傷害.Elmore R W，Nelson K A等的研究表明[10-11]，按照說明書使用對抗草甘膦大豆施用草甘膦，不會影響生長和產量.Kelly A等[12]的研究表明，草甘膦對抗草甘膦轉基因大豆的葉面積指數、生殖生長、營養生長以及產量都不會有明顯影響.然而，這些研究都停留在宏觀水平，噴施草甘膦后，關于抗草甘膦大豆的葉片表皮細胞的變化，開口氣孔個數變化及氣孔結構的變化的研究，國內外還未見有報道.

本研究以抗草甘膦大豆和東農42為材料，噴施草甘膦，利用掃描電鏡來研究草甘膦對東農42和抗草甘膦大豆的不同作用.本研究引入了草甘膦對植物的超微結構影響的研究，為草甘膦的作用機理研究拓展新的視野.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

東農42(Glycinemax(L.) Merr. Dongnong 42)由東農大豆研究所提供.轉基因大豆GTS 40-3-2(Glycinemax(L.) Merr.GTS 40-3-2)由東農轉基因作物檢測中心提供.草甘膦為41%的草甘膦異丙銨鹽.

1.2 田間噴藥

大豆種植，采用小區對比相鄰種植設計.行距62 cm，株距12 cm，行長50 m.大豆處于營養生長，第3到第5復葉期，即V3～V5期，噴施草甘膦.分別在第1次噴藥前(0 d)和噴藥后的第1、2、3、4、5、6、7 d，14 d，21 d，28 d，42 d取樣.設4個處理：東農42不噴藥、東農42噴藥、GTS 40-3-2不噴藥、GTS 40-3-2噴藥.根據說明書按1∶100噴施草甘膦.

1.3 取樣

取下葉片，置于冰盒中，帶回實驗室.葉片取材說明：取3次，每次都取第3片三重復葉的中間一片得第2葉脈與第3葉脈中間部位.

1.4 掃描電鏡觀察

掃描電鏡處理過程包括：取材、固定、沖洗、脫水、置換、用ES-2030(HITACHI)型冷凍干燥儀對樣品進行干燥、粘樣、在E-1010(HITACHI)型離子濺射鍍膜儀鍍膜、將處理好的樣品放在的S-3400掃描電鏡(日立公司)下觀察.

2 結果與分析

2.1 東農42噴施草甘膦后葉片的掃描電鏡觀察

噴施草甘膦后東農42的葉片上表皮的變化如圖1所示.

在噴藥后第4天時，東農42的上表皮細胞出現變形(圖1-17).在噴藥后第6天和第7天時，上表皮細胞變形嚴重，并下陷明顯(圖1-25，29).在噴藥后第1天時，上表皮細胞的氣孔，有部分氣孔變形(圖1-6)，到噴藥后第4天時氣孔器的內壁明顯出現皺縮的跡象(圖1-18)，這種皺縮隨噴藥天數的增加，其變形程度加大(圖1-22，26，30).

圖1 噴施草甘膦后上表皮細胞的掃描電鏡觀察圖1-1 未噴施草甘膦的東農42的葉片的上表皮，圖1-2 未噴施草甘膦的東農42的葉片的上表皮的氣孔，圖1-3 未噴施草甘膦的抗草甘膦大豆的葉片的上表皮，圖1-4 未噴施草甘膦的抗草甘膦大豆的葉片的上表皮的氣孔圖1-5，9，13，17，21，25，29 噴施草甘膦1～7 d后東農42的葉片的上表皮的變化，圖1-6，10，14，18，22，26，30 噴施草甘膦1～7 d后東農42的葉片的上表皮氣孔的變化.圖1-7，11，15，19，23，27，31 噴施草甘膦1～7 d后抗草甘膦大豆的葉片的上表皮的變化，圖1-8，12，16，20，24，28，32 噴施草甘膦1～7 d后抗草甘膦大豆的葉片的上表皮氣孔的變化.Fig.1 Epidermal cell change after spraying glyphosate under scanning electron microscopyFig.1-1 Dongnong 42 leaves upper epidermis with no spraying，Fig.1-2 Dongnong 42 leaves stomata with no spraying，Fig.1-3 Glyphosate resistant soybean upper epidermis with no spraying，Fig.1-4 Glyphosate resistant soybean leaves stomata with no spraying，Fig. 1-5，9，13，17，21，25，29 Dongnong 42 leaves upper epidermis change at 1～7 days after spraying， Fig. 1-6，10，14，18，22，26，30 Dongnong 42 leaves stomata change at 1～7 days after spraying，Fig. 1-7，11，15，19，23，27，31 Glyphosate resistant soybean leaves upper epidermis change at 1～7 days after spraying，Fig. 1-8，12，16，20，24，28，32 Glyphosate resistant soybean leaves stomata change at 1～7 days after spraying.

2.2 噴施草甘膦后的抗草甘膦大豆葉片的掃描電鏡觀察

圖1、圖2顯示了抗草甘膦大豆葉片的上表皮在噴施草甘膦后的變化.

圖2 噴施草甘膦后14，21，28，42 d抗草甘膦大豆葉片的上表皮的掃描電鏡觀察圖2-1，3，5，7 噴施草甘膦14，21，28，42 d后抗草甘膦大豆的葉片的上表皮的變化，圖2-2，4，6，8 噴施草甘膦14，21，28，42 d后抗草甘膦大豆的葉片的上表皮的氣孔的變化.Fig.2 Glyphosate resistant soybean leaves epidermal change after spraying 14，21，28，42 days under scanning electron microscopy Fig.2-1，3，5，7 Glyphosate resistant soybean upper epidermis change at 14，21，28，42 days after spraying，Fig.2-2，4，6，8 Glyphosate resistant soybean leaves stomata change at 14，21，28，42 days after spraying.

在噴藥后的42 d內，抗草甘膦大豆葉片的上表皮細胞變化不明顯(圖1，圖2).

抗草甘膦大豆的上表皮的氣孔則有一定程度變化，在噴藥后的第1天到第4天出現了氣孔器內壁的明顯變形(圖1-8，12，16，20)，但到第5天及以后(圖1-24)就未發現如此明顯的變形(圖1，圖2).

2.3 掃描電鏡下開口氣孔個數的變化

從圖1可以看出，東農42葉片在噴藥后1 d急劇下降，到第2天有所恢復，但此后又進一步減少.抗草甘膦大豆的上表皮的氣孔開口數在噴藥后第1、2天有所下降，但到第3天有所恢復，到第4、5天又減少，到第6天后逐漸恢復，接近對照.

圖3 噴藥后上表皮氣孔開口數的變化Fig.3 Change of the number of epicuticle opening stomata after spraying

3 討論

內吸性是草甘膦的特點之一，在噴施后，草甘膦將經植物表皮和氣孔進入植物體內[13]，進而影響植物的代謝.而表皮細胞作為草甘膦進入植物體的必經途徑，非常容易受到草甘膦的作用，同時植物的表皮細胞還與植物代謝息息相關.因此，研究草甘膦對大豆葉片表皮細胞的變化的研究是非常必要的.

在掃描電子顯微鏡下，可以觀察到大豆葉片的表皮細胞、氣孔的變化.草甘膦對東農42的表皮細胞及氣孔的作用是毀滅性的，但對GTS 40-3-2的表皮細胞及氣孔作用中表現出的變化，是一個先發生變化而后逐漸恢復的過程.這與草甘膦對大豆葉肉細胞的超微結構及生化指標的影響相一致[14].東農42的表皮細胞及氣孔在施草甘膦后的前期的變化，非?？赡苁遣莞熟⒓捌漭o劑的物理作用所致，而后來的變化，則是由于草甘膦抑制莽草酸途徑，影響芳香族氨基酸的合成所致.而抗草甘膦大豆GTS 40-3-2的表皮細胞及氣孔的變化，其原因則比較復雜，包括：草甘膦作為一種物理過程對細胞的損害，例如對氣孔導度，葉面溫度，滲透壓等的影響；對本身敏感EPSPS的短時間抑制；草甘膦對葉綠素合成的抑制等.大豆表皮細胞及氣孔，隨著草甘膦被吸收以及葉片的自身發育等因素的變化，其影響就逐漸消失.

雖然抗草甘膦大豆的葉片表皮細胞經過一定時間會恢復，但最終結果表現為大豆成熟期的短暫延遲，如果大豆經歷了這個時期仍可成熟，就像Nelson K A等[11]的研究，不會影響生長和產量，否則，在引入或培育抗草甘膦大豆時，就必須考慮到原始大豆品種的成熟期，而且還必須考慮到噴施草甘膦對它的影響.

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