千層塔孢子萌發研究初報

韋景楓 陶文丞 鐘 漫 蒙先舉 張聲濤 覃鳳好

(安順市林業科學研究所，貴州 安順 561000)

千層塔(HuperziaserratumThunb.),又名蛇足草、蛇足石杉等,為石杉科石杉屬多年生草本植物[1]。千層塔全草入藥,民間主治癰癤腫毒、跌打損傷等[2]。從“千層塔”中提取的生物堿——石杉堿甲是一種高效、可逆、選擇性強的乙酰膽酯酶(AchE)抑制劑,對老年癡呆癥有顯著療效,同時具有抗癌、抑制艾滋病毒、消炎等作用[3]。現存的該類植物大多生長緩慢，野生狀態下千層塔的繁殖主要以孢子繁殖為主，孢子萌發周期長，萌發后屬地下生配子體，需6～15年才能成熟[4]。不少研究人員曾開展千層塔組織培養研究,利用植物細胞工程方法生產石杉堿甲。但是,盡管采用了各種滅菌方法,植株總是帶菌,研究發現千層塔健康植株中生活著內生真菌[5]。經過表面消毒滅菌處理后的外植體在培養基上生長一段時間,又會被內生真菌所污染[6～7]。千層塔孢子數量較多，是進行千層塔植株繁殖的有利條件，作者擬開展千層塔孢子培育研究,尋找一種新的孢子處理、培養方法，進行千層塔植株再生，實現野生資源的保存、開發和永續利用。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的千層塔植株于2009年5月采自貴州省雷山縣，種植于安順市林科所試驗場以供實驗取材。取孢子囊作為外植體。

1.2 外植體滅菌

外植體首先用自來水沖洗,然后在加有洗滌劑的水中浸洗 ,最后用清水沖洗干凈。滅菌時在超凈工作臺上用70%酒精浸泡1min,然后用0.1%升汞滅菌3～4min，用無菌水沖洗4～5次，接種。

1.3 培養方法

把滅菌好的孢子囊先接種在不加激素的MS培養基上。15d后選出未污染和未白化的孢子囊繼代到1/2MS和添加GA32mg·L-1、GA35mg·L-1、GA310mg·L-1的1/2MS培養基上(20g·L-1蔗糖，7g·L-1瓊脂，pH6.0)。光照12h·d-1，光照度為24～30μmol·m-2·s-1，分別放在18～20℃、22～24℃、25～28℃下培養。每隔15d統計孢子囊的污染率和萌發率。

2 結果與分析

2.1 千層塔的外植體滅菌

采用0.1%升汞溶液滅菌，滅菌時間不同，產生的滅菌效果也不相同。處理外植體2～3min，大部分外植體在3～12d內，陸續出現污染，以真菌污染為主，細菌和雜菌污染為輔，說明滅菌時間過短，無法將表面污染源殺死；處理外植體4～5min，外植體培養在12d內出現的主要是真菌污染，呈紅褐色和灰色等(圖A，B)，污染的外植體很快被菌斑包裹，污染率為22.3%，此時的污染為外植體表面滅菌不徹底；處理外植體6～7min，大部分外植體陸續發白死亡，說明滅菌時間過長。

外植體培養43d后有的開始出現綠色細菌、白色細菌、綠色細菌伴有白色細菌、紅色細菌、其他細菌和真菌污染等，細菌和真菌生長迅速，很快就包裹外植體( 圖C，D，E)，120d統計污染率為71.2%。此時的污染主要為孢子囊內生菌。

總之，千層塔外植體的滅菌十分困難。用0.1%升汞，4～5min是比較好的，最后未出現污染的外植體為6.5%。

2.2 溫度對千層塔孢子萌發的影響

千層塔孢子分別在18～20℃、22～24℃、25～28℃下培養。在18～20℃下培養的孢子到280d還未萌發，在22～24℃培養的孢子236d孢子萌發，在25～28℃下培養的孢子219d孢子萌發。實驗表明，隨著溫度的升高有利于千層塔孢子的萌發，在25～28℃孢子萌發最快。

2.3 GA3對千層塔孢子萌發的影響

千層塔孢子分別在1/2MS和添加GA32mg·L-1、GA35mg·L-1、GA310mg·L-1培養基中培養。加GA35mg·L-1的孢子在培養219d后最先萌發，然后是加GA32mg·L-1的孢子在培養221d后萌發，加GA310mg·L-1的孢子未觀察到有萌發的，1/2MS培養基孢子在培養284d后孢子萌發。實驗表明，GA3對孢子萌發有促進作用，加GA35mg·L-1效果最好，可使孢子提前65d萌發(圖F)。

3 討論

經試驗研究，千層塔的孢子已萌發，最適合孢子萌發的培養基為：1/2MS+GA35mg·L-1，培養溫度在25～28℃。用千層塔的孢子囊作為外植體進行培養是一種比較好的材料，但孢子萌發要7個月以上，并且孢子萌發率較低，形成的配子體又很難分化出孢子體，下一步能否通過愈傷組織和GGB等途徑來形成孢子體有待進一步研究。千層塔野生資源的再生較難，用生物技術的手段對這種珍貴的藥用植物資源進行人工繁殖迫在眉睫，千層塔配子體是否含有石杉堿甲，能否從增殖的配子體上采取細胞培養提取石杉堿甲，還需進一步實驗論證。

[1]丁景和.藥用植物學[M].上海:上海科學技術出版社,1991:86.

[2]浙江省藥用植物志編寫組.浙江藥用植物志[M].杭州:浙江科學技術出版社,1980:51.

[3]李軍,韓燕.千層塔中三萜成分的研究[J].藥學學報，1988,23(7):549.

[4]中山大學生物系,南京大學生物系.植物學[M].北京:人民教育出版社,1978:137.

[5]石瑋,羅建平，丁振華,等.千層塔內生真菌分離鑒定的初步研究[J].中草藥,2005,36(2):281～283.

[6]馬華升,孫玉強,童建新,等.千層塔組織培養中外植體消毒滅菌研究初報[J].杭州農業科技,2008,(3):15～18.

[7]沈曉霞，俞旭平，盛束軍.千層塔莖尖組織培養滅菌方法的研究[J].中國中藥雜志，2002，27(6)：58.