減毒流感病毒A/California/07/2009ca疫苗候選株在雪貂上的保護性研究

段躍強 李曉楠 曹 東 魏 澍 楊鵬輝 邢 麗 王希良 李培鋒

(內蒙古農業大學獸醫學院，呼和浩特010018)

甲型流感病毒是一類可導致高發病率和高死亡率的傳染性病毒，甲型 H1N1(A/California/07/2009)流感病毒是爆發于墨西哥和美國的流感大流行的病原體，自爆發后蔓延全球，引起世界的恐慌［1-3］。截至2010年底，全球已有213個國家報道確診病例17 410例。

流感病毒在雪貂間的傳播與人類傳播最為相似，因此，目前雪貂被認為是檢測流感病毒最理想的動物模型［4-6］。通常情況下，研究人員選擇具有代表性的H1N1流感病毒在雪貂間進行傳播試驗，以評估這些病毒經飛沫傳播的可能性，同時也通過接種病毒，來觀察雪貂的發病情況［7-9］。

本實驗應用減毒A/California/07/2009ca病毒及BJ501病毒免疫雪貂，通過對雪貂的各生理指標、各器官的病毒載量的檢測，來評價減毒A/California/07/2009ca病毒的弱毒性及免疫保護性。

1 材料與方法

1.1細胞、雞胚、毒株及動物 MDCK細胞，購自ATCC公司;減毒A/California/07/2009ca流感病毒本室拯救;野毒株BJ501由中國疾病預防控制中心提供;雪貂購自江蘇無錫。

1.2主要試劑 DMEM、TPCK胰酶購自Sigma;胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司;96孔細胞培養板購自CORNING公司。

1.3TCID50的測定 用MDCK細胞鋪96孔板，每孔4×104個細胞，待長成單層后，病毒按101、102、103……倍數稀釋。每孔200 μl，稀釋液為MEM 無血清培養基(含TPCK胰酶1 μg/ml)，5天后電鏡下觀察結果，用Reed-Muench法計算TCID50，TCID50=高于50%感染病毒稀釋度的對數+(高于50%感染百分數-50)/(高于50%感染百分數-低于50%感染百分數)。

1.4A/California/07/2009ca、BJ501病毒的毒力研究 10～12周雌性雪貂每組3只，共2組，分別滴鼻免疫A/California/07/2009ca、BJ501病毒，每只免疫107TCID50/200 μl，連續14天觀察雪貂的死亡率、體重、精神狀態，并在1、2、3、4、5、7 天時應用咽拭子取鼻腔病毒［應用無血清 MEM(50 μg/ml慶大霉素)洗脫］，過濾;應用96孔細胞培養板檢測鼻腔中病毒的TCID50。

1.5A/California/07/2009ca的各器官病毒載量的研究 10～12周雌性雪貂3只，滴鼻免疫A/California/07/2009ca，每只免疫 107TCID50/200 μl，免疫 3天后取雪貂鼻、肺、脾、腦、腎等器官研磨勻漿后，離心收集病毒，應用96孔細胞培養板檢測各個器官中的病毒TCID50。

1.6A/California/07/2009ca免疫保護性研究10～12周雌性雪貂每組3只，共2組，實驗組1、21天滴鼻免疫 107TCID50/200 μl A/California/07/2009ca病毒，21、35天采血。實驗組免疫35天后和空白對照組都給予107TCID50/200 μl BJ501病毒，免疫3天后取雪貂鼻、肺、脾、腦、腎等器官研磨勻漿后，離心收集病毒，應用96孔細胞培養板檢測各個器官中的病毒TCID50。HI抗體的滴度利用4單位病毒在U型96孔血凝板上用0.5%雞紅細胞檢測。

1.7統計學處理 使用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，數據以±s表示。以t檢驗及線性回歸分析檢查不同組間差異性及其相關性，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著界限。

2 結果

2.1病毒的TCID50檢測 MDCK細胞鋪96孔板，每孔2×104～4×104個細胞，待長成單層后，A/California/07/2009ca、BJ501 病 毒 按 101、102、103……稀釋;每孔 200 μl，MEM 無血清培養基稀釋，同時以TPCK胰酶(1 μg/ml)為對照組，5天后觀察結果見表1，BJ501加胰酶前后基本沒有變化，而A/California/07/2009ca變化較大，加胰酶較不加胰酶高1.25 TCID50。

2.2滴鼻免疫A/California/07/2009ca、BJ501病毒后雪貂的生理指標檢測 A/California/07/2009ca、BJ501病毒免疫雪貂后，由表2～4可知，A/California/07/2009ca病毒免疫后雪貂精神狀態正常，沒有死亡，體重有輕微下降后又迅速恢復。而BJ501卻在3天時出現了感冒癥狀，沒有死亡，體重有小幅度的下降。

2.3滴鼻免疫A/California/07/2009ca、BJ501病毒后雪貂鼻腔病毒載量的檢測 A/California/07/2009ca、BJ501病毒免疫雪貂后，由表5可見，A/California/07/2009ca病毒在鼻腔內有較低的復制，4天后檢測不到病毒;BJ501病毒7天內都保持較高的病毒滴度。

表1 H1N1病毒的TCID50檢測Tab．1 Detection of TCID50of H1N1 virus

表2 H1N1病毒免疫雪貂后精神狀態的變化Tab.2 Mental status changes of ferrets immunized with H1N1 virus

表3 H1N1病毒免疫雪貂后死亡率的變化Tab.3 Mortality changes of ferrets immunized with H1N1 virus

表4 H1N1病毒免疫雪貂后體重的變化Tab.4 Body weight changes of ferrets immunized with H1N1 virus

表5 H1N1病毒免疫雪貂后在不同時間段鼻腔病毒載量的變化Tab.5 The nasal viral load changes of ferrets at different time points immunized with H1N1 virus

表6 A/California/07/2009ca病毒免疫雪貂后不同器官的病毒載量Tab.6 The viral load in different organs of ferrets immunized with A/California/07/2009ca virus

圖1 免疫后雪貂血清的HI實驗Fig．1 HI test of serum of immunized ferret

2.4A/California/07/2009ca病毒免疫雪貂后各器官病毒載量的檢測 A/California/07/2009ca病毒滴鼻免疫雪貂3天后，處死雪貂，由表6可見，A/California/07/2009ca病毒在鼻、肺有少量復制，脾、腎、腦中沒有檢測到病毒。

2.5A/California/07/2009ca病毒在雪貂上的免疫保護性

2.5.1HI實驗 A/California/07/2009ca病毒滴鼻免疫雪貂，采集血清樣本，分別對A/California/07/2009ca病毒及BJ501病毒做HI檢測，由圖1可見，抗體對 A/California/07/2009ca病毒及BJ501病毒都具有很好的中和效果，并且兩病毒HI結果之間無差異(P＞0.05)。

2.5.2BJ501病毒免疫雪貂后各器官病毒載量的檢測 A/California/07/2009ca病毒二免14天的雪貂和空白對照組的雪貂滴鼻免疫BJ501病毒，3天后處死雪貂;由表7可見空白對照組的雪貂在鼻、肺中檢測到較高的病毒復制，TCID50分別達到了6.9和4.6，并且腦中也檢測到1.3TCID50的病毒，腎、脾中沒有檢測到病毒。A/California/07/2009ca病毒組的雪貂在鼻、肺中檢測到少量BJ501病毒復制，脾、腎、腦中沒有檢測到病毒。

表7 BJ501病毒免疫雪貂后各器官病毒載量Tab.7 The viral load in different organs of ferrets immunized with BJ501 virus

3 討論

流感病毒具高傳染性，每年在很多國家都會造成區域性的流行，20世紀曾發生過4～5次世界大流行，每次間隔9～39年。其中以1918～1919年期間H1N1流感病毒造成4 500萬人的死亡最為嚴重。從數次大流行情況來看，H1N1爆發次數最多［10，11］。

自1998年應用流感病毒基因片段構建質粒轉染細胞得到流感病毒用以研制疫苗以來，直到現在這種方法得到的病毒株都是流感疫苗株的主要來源。減毒流感疫苗2002年首次出現報道，并在以后的發展中因其諸多優點越來越引起人們的重視，減毒流感疫苗具有抗原用量小的特點，且效果很好。適用于5～17歲健康少年兒童以及18～49歲健康成人［12］。

本實驗應用減毒A/California/07/2009ca流感病毒以BJ501病毒為對照，由表1可見，A/California/07/2009ca病毒在加入TPCK胰酶后，TCID50升高1.25倍，而BJ501病毒沒有變化，這說明A/California/07/2009ca病毒對TPCK胰酶敏感，TPCK胰酶能夠提高對A/California/07/2009ca病毒的檢測靈敏度。

A/California/07/2009ca流感病毒滴鼻免疫雪貂后，對雪貂的精神狀態(表2)、死亡率(表3)、體重(表4)等生理指標進行檢測。A/California/07/2009ca流感病毒組沒有出現異常生理反應，而BJ501病毒免疫后，雪貂出現感冒癥狀，這說明A/California/07/2009ca流感病毒毒力不足以引起雪貂機體的生理變化，同時可見A/California/07/2009ca流感病毒呈現弱毒的特征，而BJ501病毒呈現強毒的特征。

在此基礎上我們對病毒在雪貂鼻腔中的復制情況進行檢測，減毒A/California/07/2009ca流感病毒(表5)在雪貂鼻腔中4天后即檢測不到，而BJ501病毒在免疫1～7天都保持著較高的病毒滴度;從各器官病毒載量來看減毒A/California/07/2009ca流感病毒(表6)在鼻、肺中有低量復制，在脾、腎、腦中沒有病毒復制。BJ501病毒(表7)除在鼻、肺中有較高復制外，在腦中也有復制。這說明減毒A/California/07/2009ca流感病毒是弱毒的，而BJ501病毒具有較強的毒力。

A/California/07/2009ca流感病毒免疫雪貂后，從HI實驗(圖1)結果來看，A/California/07/2009ca病毒的抗體對BJ501病毒具有較好的中和效果，與A/California/07/2009ca病毒無差異;二免兩周后，BJ501病毒免疫雪貂，通過對不同器官BJ501病毒的檢測(表7)我們可以看到，和空白對照組相比，雪貂鼻、肺的病毒載量都顯著降低，腦中沒有檢測到病毒。這說明減毒A/California/07/2009ca流感病毒產生的抗體是有效的，對雪貂具有一定的免疫保護作用。

本實驗應用減毒A/California/07/2009ca流感病毒及BJ501病毒免疫雪貂，通過對雪貂機體各項生理指標的檢測及不同時間點鼻腔的病毒載量、各個器官的病毒載量、攻毒后的各個器官病毒載量的檢測，證明減毒A/California/07/2009ca流感病毒具有減毒性、不致病性及一定的免疫保護性。這些數據的獲得為今后減毒疫苗株的研發提供了實驗數據參考。

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