新型細(xì)胞色素P450氧化酶的發(fā)現(xiàn)與篩選

孫宜鋒，方渡

細(xì)胞色素 P450 是一類被廣泛研究的依賴于血紅素的氧化酶，因它在還原狀態(tài)下能與 CO 結(jié)合形成復(fù)合物，在450 nm 附近有最大吸收峰而命名為細(xì)胞色素 P450[1]。P450 首先在哺乳動(dòng)物肝微粒體中被發(fā)現(xiàn)。迄今為止，已經(jīng)命名的 P450 有 12 000 多個(gè)。P450 廣泛分布于真核生物和原核生物中，在內(nèi)源和外源化合物的代謝中發(fā)揮重要作用[2]。P450 有較高的區(qū)域選擇性和立體選擇性，可以在比較溫和的條件下在有機(jī)化合物中引入氧，催化一系列的反應(yīng)，包括脂肪族和芳香族碳的羥化、有機(jī)氮和硫的氧化、環(huán)氧化以及 Baeyer-Villiger 氧化等。其中值得關(guān)注的是，一些 P450 酶可以催化一些活性較低的碳?xì)滏I的直接氧化，這類反應(yīng)在化學(xué)合成中是比較難進(jìn)行的。因此，P450作為生物氧化催化劑引起了廣泛的關(guān)注[3]。抗瘧藥物青蒿素（artemisinin）是萜類天然產(chǎn)物的一種，在其生物合成途徑中（圖 1），反應(yīng)的關(guān)鍵步驟是由 P450 氧化酶催化完成的，首先倍半萜 FDP 前體 1 經(jīng) 4, 11-二烯合成酶的催化生成（2a），之后經(jīng)過(guò) P450 氧化酶 CYP71AV1 氧化生成artemisinic acid（2b）[4]。

由于大部分 P450 酶的活性較低、壽命較短，選擇的底物范圍較小，其工業(yè)化應(yīng)用還是很少，所以需要擴(kuò)大P450 酶庫(kù)，通過(guò)大規(guī)模的篩選，拓展酶的底物適應(yīng)性及選擇性。在已有的 P450 酶庫(kù)內(nèi)，對(duì)功能和結(jié)構(gòu)已知的酶，根據(jù)它們的晶體結(jié)構(gòu)，人們通過(guò)定點(diǎn)誘變，以及隨機(jī)突變定向進(jìn)化，可以得到一些新的 P450 酶，再篩選具有特定功能的酶[5-6]；另一方面，隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多的生物基因組序列被測(cè)定，這些基因組序列中包含了大量的 P450 基因，從這個(gè)巨大的基因組序列庫(kù)中尋找新的 P450 引起了人們很大的興趣。通過(guò)基因挖掘的方法尋找新的 P450 是目前比較常用的一種方法。

1 尋找新的 P450 氧化酶

根據(jù)氨基酸序列的同源性將 P450 歸于不同的家族或亞家族，同源性大于 40% 的歸為同一家族（如 CYP101），大于 55% 歸為同一亞家族（如 CYP101A）[7]。通過(guò)與已知的 P450 進(jìn)行同源性比對(duì)，可以推測(cè)基因序列編碼的酶屬于某一家族，并預(yù)測(cè)它可能的底物和功能，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）直接克隆得到這些 P450 基因，在合適的宿主如大腸桿菌中高效表達(dá)就可以獲得新的 P450 生物催化劑，而這些酶的底物特異性、產(chǎn)物選擇性和催化轉(zhuǎn)化率與已知的 P450 相似但不完全相同。利用這種方法，找到了已知的兩個(gè) P450、CYP102 和 CYP152 家族的新成員。

1.1 CYP102 家族成員的發(fā)現(xiàn)

CYP102A1 是在革蘭陽(yáng)性菌 B. megaterium ATCC 14581 中發(fā)現(xiàn)的，是研究的最廣泛的 P450 之一。它是一個(gè)可以自給自足的單加氧酶，包含一個(gè)血紅素結(jié)構(gòu)域，一個(gè)雙黃素還原酶結(jié)構(gòu)域和它們的連接區(qū)域。這個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其具有比其他 P450 更高的催化及轉(zhuǎn)化效率。CYP102A1利用 NADPH 作為電子供體，催化長(zhǎng)鏈脂肪酸近末端位置的羥化，它對(duì)不飽和脂肪酸底物選擇性高于飽和脂肪酸和支鏈脂肪酸[8]。CYP102A1 基因的同源基因，命名為CYP102A2、CYP102A3、CYP102A5、CYP102A7，分別從B.subtilis、B.subtilis、Bacillus cereus、Bacillus licheniformis中鑒定出來(lái)。利用 Blast 程序分析表明，CYP102A2 和CYP102A3[9]分別與 CYP102A1 有 59% 及 58% 的同源性，它們之間有 60% 的同源性，CYP102A2 對(duì)不飽和脂肪酸和支鏈脂肪酸的羥化活性比對(duì)飽和脂肪酸的羥化活性高，尤其是對(duì)支鏈脂肪酸的羥化活性比 CYP102A1 要高，而 CYP102A3 的底物選擇性與 CYP102A2 相似，只是催化活性稍低[10]。CYP102A5 與 CYP102A1 有 60%的同源性，它可以催化長(zhǎng)鏈脂肪酸的羥化，而且催化活性非常高。此外，CYP102A5 的區(qū)域選擇性比 CYP102A 家族其他成員更高。CYP102A7 與 CYP102A1 有 59% 的同源性，與其他成員不同，它對(duì)飽和脂肪酸的羥化活性比對(duì)不飽和及支鏈脂肪酸活性高，對(duì)環(huán)狀萜類也有較高的羥化活性[11]。

圖 1 青蒿素的生物合成

1.2 CYP152 家族成員的發(fā)現(xiàn)

CYP152A1 是一種單組分酶，可以利用 H2O2作為氧化劑，而不需要復(fù)雜的電子傳遞系統(tǒng)和昂貴的 NAD(P)H，有利于它的實(shí)際應(yīng)用。CYP152A1 是基于與 CYP152B1的序列相似性而在 B. subtilis 168 基因組序列中發(fā)現(xiàn)的[12]。與 CYP152B1 催化脂肪酸 α 位羥化不同，CYP152A1 催化飽和脂肪酸的 β 位羥化。它可能是酰基肽類抗生素合成途徑中的一個(gè)酶，因?yàn)檫@類抗生素中含有 β-羥基脂肪酸[13]。基于與 CYP152A1 的序列相似性，在厭氧菌Clostridium acetobutylicum ATCC 824 中發(fā)現(xiàn)了 CYP152A2。它與 CYP152A1 有 59% 的氨基酸序列同源性，可以利用H2O2為氧化劑，催化肉豆蔻酸 α 及 β 位的羥化[14]。

1.3 根據(jù)基因組序列分析發(fā)現(xiàn)新的 P450

在一些抗生素的生物合成基因簇中經(jīng)常包含一些 P450基因，催化其中某些重要的反應(yīng)步驟，如埃博霉素和柔紅霉素生物合成途徑中就有 P450 發(fā)揮作用。隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，很多菌株已經(jīng)完成了全測(cè)序，利用在線軟件（Blast）分析基因組序列中的開放讀碼框，推測(cè)出基因組序列中包含的一些 P450 基因，這些基因編碼的酶的功能是未知的，需要表達(dá)這些基因，再通過(guò)一些高通量的篩選方法確定它們的底物和活性，這樣就確定了一個(gè)新的P450，它們的底物選擇性及功能都與已知的 P450 不同。Lamb 等[15]從全測(cè)序的 Streptomyces coelicolor A3(2) 中推測(cè)出了 18 個(gè) P450 基因，其中鑒定出 CYP105D5 可以催化脂肪酸羥化。Sakaki 等分析 Streptomyces griseolus 的基因中的 P450 體系，包括 CYP105A1，通過(guò)在 Escherichia coli 中表達(dá)以后分析發(fā)現(xiàn)，CYP105A1 可以催化 VD2和VD3的 25 位羥化[16]。

1.4 我們的研究

我們根據(jù)分析基因組序列信息的方法，從新型抗腫瘤抗生素 Yatakemycin 的產(chǎn)生菌鏈霉菌 TP-A2060，生物農(nóng)藥金核霉素的產(chǎn)生菌鏈霉菌 Streptomyces 371 這兩個(gè)本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行全測(cè)序的鏈霉菌菌株中，分別發(fā)現(xiàn)了 19 和 18個(gè) P450 基因，利用在線軟件分析這些 P450，把它們劃分到不同的 CYP 家族。然后利用分子生物學(xué)克隆表達(dá)方法，在大腸桿菌中表達(dá)得到可溶蛋白，確立了菌株中的P450 體系，并進(jìn)一步研究他們的功能與活性。

2 P450 催化活性的篩選方法

根據(jù)上面的介紹可以發(fā)現(xiàn)，雖然通過(guò)分析基因組序列信息可以尋找到一些新的 P450 酶，但是有時(shí)只通過(guò)基因組序列信息本身還不能確定酶的底物和功能，就需要高效、合適的篩選方法與之配合才能鑒定得到新的 P450 氧化酶。根據(jù) P450 庫(kù)的大小和作為潛在底物的化合物的數(shù)量，有以下幾種篩選方法可以檢測(cè) P450 的催化活性。

2.1 幾種高通量的篩選方法

目前通用的檢測(cè)方法是檢測(cè) NAD(P)H、氧氣和過(guò)氧化物，這種方法適用于只檢測(cè)氧化活性而不考慮底物的類型。NAD(P)H 在 340 nm 有吸收，檢測(cè)隨著底物的氧化NAD(P)H 的消耗量，這種方法在酶的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常應(yīng)用[9]。Tsotsou 和他的同事建立了另一種方法：檢測(cè)NAD(P)+的產(chǎn)生量。這個(gè)方法是檢測(cè)堿溶液中 NAD(P)+在 360 nm 的吸收，雖然在強(qiáng)堿溶液中 NAD(P)+的消光系數(shù)幾乎和 NAD(P)H 是一樣的，對(duì)活性較低的酶來(lái)說(shuō)檢測(cè) NAD(P)+的產(chǎn)生量還是要比檢測(cè) NAD(P)H 的消耗量可靠[17]。檢測(cè)氧氣也是一種有用的方法，氧傳感器已經(jīng)用于 P450 的底物篩選中了，這種商用微系統(tǒng)利用的原理是釕染料的熒光在有氧氣存在的條件下大幅淬滅[18]。另外，一些 P450 如 CYP152A1，利用過(guò)氧化物為氧化劑，可以利用比色法檢測(cè)。最近，Rabe 等[19]建立了一種檢測(cè)有機(jī)過(guò)氧化物的方法：以過(guò)氧化氫酶為指示酶，催化 Amplex Red 和有機(jī)過(guò)氧化物形成有熒光的化合物。

2.2 直接檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物

與檢測(cè) NAD(P)H、氧氣、過(guò)氧化物的方法相比，直接檢測(cè)氧化產(chǎn)物更可靠，可以減少假陽(yáng)性結(jié)果。反應(yīng)如果產(chǎn)生有顏色的或者有熒光的產(chǎn)物，可以更容易檢測(cè)到活性。例如，有一類 P450 對(duì)吲哚有氧化活性，可以產(chǎn)生一些色素，如靛藍(lán)和靛玉紅[20]。

2.3 一類新的精確檢測(cè)的方法

高效液相色譜（HPLC）以及質(zhì)譜（MS）為 P450 的活性檢測(cè)提供了更通用而精確的方法。雖然與色譜法相比這些方法的通量較低，科學(xué)家也在努力提高質(zhì)譜法的檢測(cè)通量[21]。Tang 等[22]建立了一種利用 LC-MS 及同位素標(biāo)記的方法確定 P450 底物的方法。他們篩選組織提取物作為P450 的內(nèi)源性底物：首先建立一個(gè)含有輔因子和組織提取物的 P450 反應(yīng)體系，并在體系內(nèi)以 1:1 的比例加入18O2/16O2，然后利用 LC-MS 檢測(cè)反應(yīng)體系中的有機(jī)提取物，最后用生物信息學(xué)工具分析，同位素標(biāo)記的產(chǎn)物以M/M+2 雙峰的形式出現(xiàn)。傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FT-ICR/MS）具有極高的質(zhì)譜分辨率和精確度，對(duì)復(fù)雜的混合物可以直接進(jìn)樣分析而不用先進(jìn)行色譜分離，在底物分離試驗(yàn)中引起了廣泛的興趣[23]。Furuya 建立了一種利用FT-ICR/MS 篩選單加氧酶底物的策略[24]，利用這種方法，他們發(fā)現(xiàn)了三個(gè)枯草桿菌 P450（CYP107J1、CYP109B1 和CYP134A1）和三個(gè)蠟狀芽孢桿菌 P450（CYP106、CYP107和 CYP109）。

2.4 篩選與檢測(cè)方法的應(yīng)用

圖 2 CYP199A2 催化的反應(yīng)

利用基因挖掘的方法可以找到更多新的 P450，高通量的質(zhì)譜檢測(cè)方法在對(duì)這些酶的底物進(jìn)行大量篩選時(shí)會(huì)非常有用。尋找與篩選方法相結(jié)合，從基因庫(kù)中挖掘得到了一些全新的 P450，例如 CYP199A2 就可以催化一系列有趣的反應(yīng)。CYP199A2 在較早被報(bào)道對(duì)對(duì)位取代的苯甲酸有氧化活性，它是一類高效的芳香酸氧化酶[25]。而 Furuya和 Kino 在通過(guò)比色檢測(cè)法篩選約 100 個(gè)細(xì)菌 P450 對(duì)2-萘酸的羥化活性的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，CYP199A2 是一個(gè) 2-萘酸單加氧酶。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，CYP199A2 可以把2-萘酸氧化為 7 位或 8 位羥化的 2-萘酸，它也可以催化三種羥基 2-萘酸氧化為相應(yīng)的二羥基-2-萘酸，選擇性的氧化吲哚及喹啉酸[26]。圖 2 列舉了 CYP199A2 催化的一些反應(yīng)。

3 結(jié)論

利用基因組序列鑒定的 P450 基因形成了一個(gè)大的基因庫(kù)，作為新的生物氧化劑的來(lái)源引起了廣泛的關(guān)注。利用已知功能的 P450，如 CYP102A1 和 CYP152A1 的同源基因，可以挖掘出具有新的底物特異性和產(chǎn)物選擇性的酶。另外，一些 P450 家族的酶催化機(jī)制目前仍然是未知的。將來(lái)通過(guò)基因序列分析可以更快地獲得推定的 P450，但是單靠基因序列信息不能確定酶的底物，就需要利用一些高通量的分析方法，如質(zhì)譜法對(duì)這些酶的底物進(jìn)行大規(guī)模的篩選。基因序列信息還可用于鑒定 P450 的氧化還原配體，這些配體又在對(duì) P450 的催化活性進(jìn)行優(yōu)化的過(guò)程中有重要影響。除了在體外篩選和鑒定酶的底物，鑒定和分析新發(fā)現(xiàn)的 P450 的晶體結(jié)構(gòu)不僅可以得到大量具有形形色色底物專一性的生物氧化酶，也可以獲得 P450 新的生化特征。基因挖掘的方法與其他現(xiàn)有的及新的技術(shù)相結(jié)合，為生物催化氧化更廣泛的應(yīng)用提供了新的可能性。

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