雌激素對人臍帶來源間充質細胞骨架和超微結構的影響

趙葉琳，趙曉寅，孫凌云，侯亞義

人臍帶間充質干細胞（MSC）具有免疫抑制作用和多向分化潛能，被用于治療各種疾病。而雌激素與許多自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展有關，以前的研究中發(fā)現(xiàn) 17β-雌二醇（E2）能影響破骨細胞內細胞骨架的結構，下調微絲肌動蛋白（F-actin）的表達，降低破骨細胞的活動能力，從而抑制破骨細胞的骨吸收功能[1-2]。E2對 MSC 有多種調節(jié)作用，如能抑制 MSC 的成骨分化[3]及抑制 MSC 的免疫調節(jié)功能[4]。但關于 E2 對 MSC 細胞骨架和超微結構的影響還未見報道。

F-actin 呈纖維狀，是構成細胞內微絲骨架的主要部分。肌動蛋白相關蛋白2/3（Arp2/3）復合物又是構成 F-actin 的結構基礎[2]。F-actin 在細胞內的聚合及解聚，與細胞的運動、形態(tài)及細胞內外的信息傳遞等功能有關，為細胞內外信息傳遞提供分子橋梁，控制細胞形態(tài)、運動和增殖等生物效應[5-6]。

紐蛋白（vinculin）是一種與黏著類型連接形成有關的細胞骨架蛋白，存在于細胞—細胞及細胞—基質間的黏著部位，其作用是將 F-actin 錨著于連接點形成部位的細胞膜上[7]。紐蛋白的表達對 MSC的黏附功能有著重要作用[8]。

本研究中，我們通過激光共聚焦顯微鏡（laser confocal microscope，LCM）觀察了 E2 作用下細胞骨架和細胞連接的情況，用透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察細胞內部細胞器的變化，探討 E2 作用后 MSC 功能變化的可能原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 自然足月剖腹產的健康胎兒臍帶，獲自南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院。所用材料均嚴格遵守醫(yī)學倫理道德，經(jīng)產婦及家屬認可，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12 培養(yǎng)基和優(yōu)級胎牛血清（FBS）購自美國 Gibco 公司；膠原酶 II、中性蛋白酶、透明質酸酶購自美國 Sigma 公司；熒光標記小鼠抗人抗體 PE-CD117、PE-CD44、PE-CD29、FITC-CD31、FITC-CD45 和 APC-CD105單克隆抗體購自美國 Ebioscience公司；鼠 IgG-PE、鼠抗人紐蛋白單克隆抗體購自美國 Santan 公司；17β-雌二醇、鬼筆環(huán)肽（Phalloidin- FITC）購自美國 Sigma 公司；明膠、牛血清白蛋白（BSA）購自中國 sunshine 公司；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton 100）購自中國 beyotime 公司。

1.1.3 儀器 FACSCalibur 流式細胞儀為美國BD 公司產品；FV10i 型激光共聚焦顯微鏡為日本Olympus 公司產品；Philipscm12 型透射電子顯微鏡為荷蘭 Philips 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶來源間充質細胞的分離及純化 取足月剖腹產胎兒的臍帶，在無菌狀態(tài)下用預冷的含 0.01%青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，去掉臍帶內血塊。在 DMEM/F12 基本培養(yǎng)基中，將臍動脈剝除，其余部分剪成 2mm3碎塊，250 U/ml 的膠原酶 II、100 U/ml 中性蛋白酶和 10 U/ml 透明質酸酶以 1∶1∶1 的比例加入組織中，37℃振蕩消化 3 h 至組織基本消化完全。離心去上清，用基本培養(yǎng)基洗 3 次，再培養(yǎng)于含 10%FBS 的 DMEM/F12 完全培養(yǎng)基中。調整細胞密度為1×109個/L，于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4 d 后，輕輕晃動培養(yǎng)板，全量換液，待細胞鋪滿度達 80%左右，用 2.5 g/L 的胰酶消化，常規(guī)傳代。取第3 代細胞，分析其表面標志，確定其為MSC 后用于試驗。

1.2.2 流式細胞儀測定細胞表面標志 消化、收集細胞，PBS 洗滌 2 次，調整細胞密度約 1×106個/ml。共 3 例臍帶 MSC，每個標記設 3 復孔，加入同型對照和相應抗體，4℃避光孵育 30min，PBS 洗滌 2 次后上機檢測。MSC 檢測標志為：CD117、CD29、CD31、CD44、CD105 及 CD45。

1.2.3 細胞爬片及免疫熒光標記 將蓋玻片用75%酒精浸泡 30 s，換到 95%酒精浸泡 30 s，燒干蓋玻片。將蓋玻片放到 12 孔培養(yǎng)板里，加覆500 μl 左右 1%的無菌明膠，37℃孵育 2 h，吸去明膠，PBS 洗，5×105個/ml 細胞懸浮于完全培養(yǎng)基中，每孔加入 1 ml 細胞懸液，分別加入10-7nmol/L 和 10-8nmol/L 的 E2 處理 12、24 和48 h。對照組相同體系培養(yǎng)，以同體積的 PBS 代替 E2。將細胞爬片用 4%多聚甲醛固定 30min，PBS洗 3 次，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton 100）室溫處理 15min，PBS 洗 3 次，用 3%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉 1 h，PBS 洗，加一抗鼠抗人紐蛋白單抗，4℃過夜。PBS洗 3 次，分別加抗鼠 IgG-PE 和 Phalloidin-FITC，室溫孵育1 h，PBS洗 3 次，最后 DAPI 染核 10min，PBS洗 3 次，加防熒光猝滅劑封片。

1.2.4 透射電鏡樣品制備 將 E2 處理過的臍帶MSC 200×g離心 5min，用預冷的 PBS 洗滌2 次，2.5%戊二醛（0.01 mol/L 二甲胂酸鈉配制）固定 4℃過夜。0.01 mol/L 二甲胂酸鈉緩沖液洗滌，l%鋨酸 4℃固定 l h。梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂 Epon812 包埋，常規(guī)超薄切片，醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙染色后置透射電鏡下觀察。

2 結果

2.1 MSC 的形態(tài)學觀察和表面標記物檢測

原代培養(yǎng)早期細胞形態(tài)異質性較大，以梭形、多角形為主。消化傳代后，從第3 代起開始穩(wěn)定生長，可獲得較均一的 MSC。細胞形態(tài)為梭形或成纖維樣，體積較大，單核，呈漩渦樣生長（圖1）。流式細胞儀檢測顯示，臍帶 MSC 穩(wěn)定均一地表達CD29 和 CD44（纖維蛋白和透明質酸鹽的受體，由基質細胞表達）、CD105（SH-2）；不表達 CD117（多能造血干細胞標志）、CD31（內皮細胞標志）和 CD45（造血細胞標志）。經(jīng) 3 代以上傳代后，細胞成分均一，純度在 95%以上（圖2）。

圖1 人臍帶來源 MSC 的細胞形態(tài)（A：第2 代；B：第3 代）Figure 1 The morphology of human umbilical cord MSC (A:P2; B: P3)

2.2 LCM 觀察細胞骨架

正常的臍帶 MSC 細胞 F-actin Phalloidin-FITC 熒光染色為綠色，呈細絲狀，主要沿細胞長軸分布，貫穿整個 MSC 細胞（圖3A）。Vinculin 免疫染色為紅色，呈點狀，簇狀著染于肌動蛋白兩端，分布于胞漿中細胞膜側（圖3B，白色箭頭）。胞漿與細胞核中見非特異性著染，細胞核染色為藍色。10-7nmol/L E2處理 48 h 后，對肌動蛋白分布無太大影響（圖3D），Vinculin 主要分布于胞漿中靠細胞核側（圖3E）。10-8nmol/L 組各時間點細胞形態(tài)及肌動蛋白分布均無明顯變化。

2.3 TEM 觀察細胞超微結構

圖2 人臍帶 MSC 的表面標志（陰影部分為同型對照）Figure 2 The surface marker of human umbilical cord MSC (Shadow area was isotype control)

圖3 E2 作用后 MSC 細胞骨架的變化（F-actin 著染綠色熒光，白色箭頭指向的紅色亮點為vinculin） （A：對照組 F-actin--FITC 熒光染色；B：對照組 vinculin 熒光染色；C：對照組 F-actin 和 vinculin 染色疊加；D：E2 組 F-actin--FITC 熒光染色；E：E2 組 vinculin 熒光染色；F：E2 組 F-actin 和 vinculin 染色疊加）Figure 3 Changes of cytoskeleton of MSC after E2 treatment [ Cell cytoskeleton proteins F-actin (Green) and vinculin (Red, white arrows showed vinculin) ](A: Control FITC-F-actin; B: Control PE-vinculin; C: A and B overlap; D: E2 FITC-F-actin; E: E2 PE-vinculin; F: D and E overlap)

10-7nmol/L E2 處理 MSC 48 h 后，透射電鏡觀察細胞的超微結構。對照組細胞核呈圓或卵圓不規(guī)則形，雙層核膜完整，核仁大而明顯，常異染色質分布均勻，粗面內質網(wǎng)、滑面內質網(wǎng)、線粒體等細胞器數(shù)量豐富、結構清晰（圖4A、B、C）。E2 處理后的 MSC 透射電鏡下見有部分細胞開始出現(xiàn)結構異常現(xiàn)象，有的胞質內出現(xiàn)大量大小不等的空泡（圖4D）和自噬體，自噬體內含有未被完全消化的殘余細胞器和胞質成分，即髓鞘樣小體（圖4F）。

圖4 E2 作用后 MSC 細胞超微結構的變化（箭頭指向細胞空泡和自噬體） （A：對照組 10 000×；B：對照組 20 000×；C：對照組 40 000×；D：E2 組 10 000×；E：E2 組 20 000×；F：E2 組 40 000×）Figure 4 Changes of ultrastructure of MSC after treated with E2 (Arrows showed vacuoles and autophagosome) (A: Control 10 000×; B: Control 20 000×; C: Control 40 000×; D: Treat with E2 10 000×; E: Treat with E2 20 000×; F: Treat with E2 40 000×)

3 討論

細胞骨架在細胞的增殖，維持細胞形態(tài)、極性、內吞作用，胞內物質運輸，信號轉導，細胞活性，運動能力等方面起著重要作用。細胞骨架包括微管、微絲和中間絲三部分，分別與細胞膜上的蛋白質和脂分子相互連接，成為細胞運動、細胞形態(tài)和跨膜信息傳遞的基礎。F-actin 呈纖維狀，構成細胞內微絲骨架的主要部分，而 Arp2/3 復合物是構成F-actin 的結構基礎。微絲的肌動蛋白有兩種存在方式：一種是聚合態(tài)（F-actin），另一種是游離狀態(tài)（G-actin）。當細胞功能活躍時，F(xiàn)-actin 伸長通過其膜上黏著相關分子（肌動蛋白結合蛋白）介導，將肌動蛋白連接于細胞外基質，將軸突向此方向拉動。當不能與細胞外基質形成黏著類型的連接時，F(xiàn)-actin 解聚。這種解聚和聚合的變化與細胞的附著、運動、形態(tài)及細胞內外的信息傳遞等功能有關，為細胞內外信息傳遞提供分子橋梁，控制細胞形態(tài)、運動、增殖等生物效應[9]。微絲肌動蛋白的聚合和解聚隨著生理和病理條件發(fā)生改變，在本實驗中，用共聚焦顯微鏡未觀察到 F-actin 在分布和表達水平的變化。

Vinculin 是一種與黏著類型連接形成有關的細胞骨架蛋白，其作用是將 F-actin 錨著于連接點形成部位的細胞膜上。已有報道，在培養(yǎng)細胞的胞漿內有一紐蛋白池，其與膜聯(lián)的紐蛋白間形成動力學平衡[3-4]。通過這種平衡，來控制細胞的形態(tài)和運動能力。目前關于點狀連接部位紐蛋白分布及作用的報道很多，但關于胞漿內紐蛋白池在細胞超微結構的分布，至今未見報道。本實驗結果表明，正常情況下紐蛋白在靠近細胞膜側分布，認為是細胞與培養(yǎng)基質間形成黏著連接的部位，而胞漿內的紐蛋白呈均勻的網(wǎng)格狀分布，可能與微絲的分布相關。而經(jīng) E2 處理后，紐蛋白主要分布于胞漿中靠細胞核側。這種變化可能導致胞漿內紐蛋白池與膜聯(lián)的紐蛋白間動力學失衡。從而影響 MSC 的運動和趨化至病理部位的能力。

細胞的超微結構顯示了細胞中細胞器的形態(tài)、數(shù)量的變化，從而揭示了細胞的分裂、衰老和凋亡情況。透射電鏡的結果表明，正常 MSC 超微結構良好，細胞器較豐富，有完成最基本細胞功能的細胞器，如線粒體、核糖體、粗面內質網(wǎng)等。E2 處理后，MSC 超微結構則明顯出現(xiàn)了衰老和凋亡特征：細胞內出現(xiàn)了大量空泡（可能來源于線粒體腫脹變性），周圍出現(xiàn)雙層膜空泡結構，繼而雙層膜環(huán)繞成自噬體，進而與溶酶體融合、消化，形成自噬體不能消化的殘體。這些變化表明細胞的蛋白合成和有氧呼吸功能受到影響，大量細胞內具有較多的自噬體和消化未盡的髓鞘樣小體，表明這些細胞可能出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，而其自身已經(jīng)開始了自我保護性反應。粗面內質網(wǎng)和線粒體數(shù)量反而增加，可能是細胞為了維持平衡出現(xiàn)的代償性增加。樸英杰等[10]首次提出了細胞自噬性凋亡的概念，闡明其為一種細胞自我保護反應。當細胞進入衰老階段或功能異常時，也可通過細胞凋亡來結束自身的生命。我們觀察到的細胞中也有自噬性凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。總之，E2 存在的情況下，MSC 的超微結構和細胞骨架發(fā)生異常，這種異常可能與 E2 作用下 MSC的增殖、凋亡、貼壁以及遷移能力的變化有關。

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