利用分枝桿菌的重組工程系統將TAP標簽敲入恥垢分枝桿菌的方法研究＊

趙麗麗,夏 強,2,趙秀芹,萬康林

利用分枝桿菌的重組工程系統將TAP標簽敲入恥垢分枝桿菌的方法研究＊

趙麗麗1,夏 強1,2,趙秀芹1,萬康林1

目的 利用pJV 53質粒編碼的分枝桿菌重組工程系統將TAP標簽敲入恥垢分枝桿菌基因組。方法將pJV 53質粒轉入恥垢分枝桿菌,使其表達重組蛋白,制備帶有重組蛋白的感受態細胞;從質粒pBS1479中擴增出 tap片段,從質粒pSM T3中擴增hyg片段,從恥垢分枝桿菌基因組中分別擴增出aasf基因及其5′端非編碼區片段AASF5和aasf基因下游3′端非編碼區片段AASF3,利用重疊PCR將以上4個片段拼接在一起,形成最終的敲入片段A 5THA 3;將構建好的敲入片段轉入感受態細胞,使其重組入恥垢分枝桿菌基因組中,PCR和DNA測序鑒定敲入效果。結果重疊 PCR技術得到全長為3 200 bp的敲入片段,PCR與DNA測序結果證實帶有TAP標簽的A 5THA 3片段已成功敲入恥垢分枝桿菌基因組中。結論成功將 TAP標簽敲入恥垢分枝桿菌基因組,為下一步進行目的基因功能研究奠定了基礎。

重組工程系統;pJV 53質粒;串聯親和純化標簽;敲入片段;重疊PCR;恥垢分枝桿菌

“重組工程”是近幾年興起的一種新型體內同源重組的遺傳工程技術,它是由噬菌體重組酶介導的體內同源重組,可有效促進線性DNA分子和染色體間的重組,能直接在體內對染色體DNA進行基因敲除、敲入或替換。

pJV 53質粒[1]是一種大腸桿菌-分枝桿菌穿梭載體,能編碼產生Che9c分枝桿菌噬菌體的gp60和gp61蛋白,它們分別是重組蛋白 RecE和 Rec T的同源物,能幫助外來基因序列重組入分枝桿菌,且所需同源序列短,重組效率高;aasf基因編碼產生AASF蛋白,它在恥垢分枝桿菌中的功能尚不清楚;TAP-tag的敲入是進行串聯親和純化技術(tandem affinity purification,TAP)[2-3]的關鍵,TAP技術是近年來出現的一種能快速研究生理條件下蛋白質相互作用的新方法,該技術有助于我們進一步認識蛋白質的功能。

本研究首先將pJV 53質粒轉入恥垢分枝桿菌M.smegm atism c2155,加入誘導劑,使其表達重組工程系統——gp60和gp61,制備帶有 gp60和gp61的恥垢分枝桿菌感受態細胞;利用overlap PCR技術將tap序列、hyg序列(用作選擇性標記)和目的基因(aasf)及其3′端非編碼序列(用作重組)拼接在一起形成最終的敲入(knock-in)片段A 5THA 3(見圖1);將A 5THA 3轉入感受態細胞,在重組蛋白gp60和gp61的幫助下,A 5THA 3成功敲入待研究的恥垢分枝桿菌靶基因(aasf)處,為下一步利用TAP技術研究靶基因的功能奠定基礎。

圖1 Overlap PCR構建TAP敲入片段Fig.1 Construction of tap TAP knock-in cassette by overlap PCR

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株pBS1479 質粒(含 tap基因)購于 EUROSCARF,pSM T3質粒(含 H ygrom ycin B抗性基因,hyg)由倫敦帝國理工學院Robertson博士惠贈,大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質粒pJV 53由匹茲堡大學的 Hatfull教授惠贈,M.smegm atis m c2155購自A TCC,DH5a大腸桿菌為本室保存。

1.1.2 主要試劑 Pyrobest DNA聚合酶,Bam H I,H in d III,T4DNA連接酶購自 Takara公司,質粒小提試劑盒、PCR產物回收試劑盒、膠回收試劑盒、Tarns2KTMPlusⅡDNA M arker購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制備重組工程菌株將質粒 pJV 53通過電擊轉化轉入M.smegm atism c2155感受態細胞中,電擊參數為:電壓 2.5 kV,電阻1000Ω,電容 25 μF。電擊過后,立即加入1 m L的7H9培養基,37℃振蕩培養2 h,立即涂于7H10(含 KAN,OADC)抗性平板[4]。

1.2.2 制備重組工程菌株感受態細胞 挑取新鮮的含有pJV 53質粒的單菌落接種于5 mL 7H9培養基(含 KAN,ADC和0.05%Tween-80)中,37 ℃振蕩培養至OD600值0.6左右,接種至200 m L的7H9培養基(成分同上),37℃過夜培養至OD600值0.4左右,加入乙酰胺(0.2%),繼續培養2～3 h。將培養物冰上放置0.5～1 h,4℃,5 000 r/min離心10 min收集菌體,將菌體用100 m L預冷的10%的無菌甘油重懸,4℃,5 000 r/m in離心10 m in,收集菌體,重復清洗菌體3次,所用10%的甘油體積依次減為50 m L,25 m L,12.5 m L,最后加入5 m L預冷的10%的甘油,吹勻菌體后,以0.2 mL/管分裝保存于-80℃。

1.2.3 利用overlap PCR技術擴增敲入片段 反應分幾步進行:

①從質粒pBS1479中擴增出 tap片段(作為②的上游片段),長度約為600 bp,引物為 Tap-5和Tap-3;從質粒p SM T3中擴增 hyg片段(作為②的下游片段),長度約為 1 200 bp,引物為 Hyg-5和Hyg-3;從恥垢分枝桿菌基因組中分別擴增出 aasf基因及部分5′端非編碼區片段AASF5,長度約為650 bp,引物為AASF5-5和AASF5-3,aasf基因下游3′端非編碼區片段AASF3,長度約為550 bp,引物為AASF3-5和AASF3-3,PCR反應體系總體積均為50μL,其中 10×Pyrobest PCR Buffer 5μL,dN TP(2.5 mmol)4μL,Forward Primer(20 mmol)1μL,Reverse Primer(20 mmol)1μL,DNA模板 1μL,Pyrobest DNA Polymerase 0.3 μL,無菌雙蒸水37.7μL,PCR反應條件均為:95℃5 min,94℃1 min,64℃1min,72℃1 min 30 s,25次循環;72℃5min。

②通過overlap PCR將 tap基因和抗性基因hyg連接起來,形成片段 TH,長度約為1 800 bp,所用引物為 Tap-5和 Hyg-3。反應體系總體積均為50μL,其中 10×Pyrobest PCR Buffer 5μL,dN TP(2.5 mmol/L)4μL,Forward Primer(20 mmol/L)1μL,Reverse Primer(20 mmol/L)1μL,上游片段 1μL,下游片段 1μL,Pyrobest DNA Polymerase 0.3μL,無菌雙蒸水36.7μL。PCR反應條件為:95℃5 min;94℃1 min,64℃1 min,72℃2 min,25次循環;72℃5 min。

③利用同樣方法,將 TH片段與AASF3相連接,形成片段 THA 3。上游片段引物為 Tap-5和H3,模板為 TH片段,PCR反應體系同①,PCR反應條件同②。下游片段引物為 H 5和AASF3-3,模板為AASF3片段,PCR反應體系和條件均同①。THA 3片段引物為 Tap-5和AASF3-3,PCR反應體系同②。PCR反應條件為:95℃5 min;94℃1 min,64℃1 min,72℃3 min,25次循環;72℃5 min。

④擴增全長敲入片段(A 5THA 3)。上游片段引物為 AASF5-5和 AASF-U 3,模板為 AASF5片段,PCR反應體系和條件均同①,下游片段引物為AASF-D5和 AASF3-3,模板為 THA 3片段,PCR反應體系同 ①,PCR反應條件同 ②。擴增A 5THA 3片段的PCR反應體系同②,PCR反應條件為:95℃5 min;94℃1 min,62℃1min,72℃4m in,25次循環,72℃5 min。本研究所涉及的引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 The primer sequence

1.2.4 通過重組系統將構建好的A 5THA 3片段敲入基因組中的相應位置 將A 5THA 3片段進行膠回收純化,吸取100 ng純化產物電擊轉化入重組工程菌株感受態細胞中,37℃振蕩培養4 h,然后將轉化產物涂平板(含有 Kan+Hyg抗性),37℃倒置培養3～5 d后,挑取陽性克隆進行菌體PCR驗證。1.2.5 PCR和基因測序驗證重組子 分別用引物AASF5-5,Tap-3和AASF5-5,AASF-D5進行菌液PCR擴增,反應體系為 50μL,其中 10×Pyrobest PCR Buffer 5μL,dN TP(2.5 mmol/L)4μL,Forw ard Primer(20 mmol/L)1μL,Reverse Primer(20 mmol/L)1μL,菌液 1μL,Pyrobest DNA Polymerase 0.3μL,無菌雙蒸水 37.7μL。PCR反應條件為:95℃5 min;94℃1 min,64℃1 min,72℃3 min,30次循環;72℃5 min。將PCR產物純化并送擎科生物技術公司測序。

2 結 果

2.1 利用overlap PCR技術得到 TH片段 分別以PCR擴增出的 tap和 hyg為模板,Tap-5和Hyg-3為引物,overlap PCR得到 TH片段,長度大約為1 800 bp,如圖2。

圖2 overlap PCR得到TH片段Fig.2 Overlap PCR product of TH fragment M:DNA marker 1:TH fragment

2.2 利用overlap PCR技術得到 THA 3片段 以TH片段為模板,Tap-5和 H3為引物,PCR得到上游片段;AASF3片段為模板,H5和AASF3-3為引物,PCR得到下游片段;以上下游片段為模板,Tap-5和AASF3-3為引物,PCR得到 THA 3片段,長度大約為2 400 bp,如圖3。

圖3 overlap PCR得到THA3片段Fig.3 Overlap PCR product of THA3 fragment M:DNA marker 1:THA 3 fragment

2.3 利用overlap PCR技術得到A 5THA 3片段以AASF5片段為模板,AASF5-5和AASF-U 3為引物,PCR得到上游片段;THA 3片段為模板,AASF-D5和AASF3-3為引物PCR得到下游片段;以上下游片段為模板,AASF5-5和AASF3-3為引物,PCR得到 THA 3片段,長度大約為3 100 bp,如圖4。

圖4 overlap PCR得到敲入片段A5THA3Fig.4 Overlap PCR product of knock-in fragmen t A5THA3 M:DNA marker 1:A 5THA 3 fragment

2.4 將A 5THA 3片段敲入恥垢分枝桿菌的 aasf基因位置 將A 5THA 3敲入片段膠回收純化,電擊轉化入恥垢分枝桿菌細胞內,利用新發展起來的基于分枝桿菌的重組工程系統,將A 5THA 3片段整合到恥垢分枝桿菌基因組的aasf基因處,利用敲入片段上的潮霉素抗性基因篩選陽性克隆,再對篩選出的克隆進行PCR檢測以驗證重組子是否發生重組。其中的一條引物是AASF5-5,另一條引物是Tap-3,只有整合了 TAP-tag的重組子才能擴增出相應大小的條帶,而野生型菌是無法擴增出條帶的,如圖5。

圖5 PCR驗證重組子Fig.5 Identification of the recombinants by PCR M:DNA marker;1,2:recombinants;3:wild-type

同時,利用兩條外側引物AASF5-5和AASFD5進行PCR擴增時,重組子由于敲入了帶有 TAP標簽和抗性基因的 TH片段,與野生型相比,就多出這段外源序列,圖6驗證了這一結果,證明已成功將TAP-tag片段敲入恥垢基因組中 aasf基因的C端,測序結果也顯示tap片段成功整合在aasf基因的 3′端。

3 討 論

串聯親和純化技術(tandem affinity purification,TAP),特別適用于研究蛋白質在生理條件下的相互作用。該技術的關鍵是將一個純化標簽(TAP-tag)引入靶蛋白質一端,不破壞靶蛋白質的序列,且不改變靶蛋白在生物體內的表達水平,經過親和純化獲得接近自然條件的特定蛋白質復合體,以便于下一步的分離鑒定,目前,TAP技術已成功運用于大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞及哺乳動物細胞,但在分枝桿菌菌體內,還未有這方面的應用報道。

圖6 PCR驗證重組子Fig.6 Identification of the recombinants by PCR M:DNA marker;1,2:recombinants;3:wild-type

重組工程系統最早應用于大腸桿菌,包括基于缺陷型λ噬菌體的Red重組系統[5-6]和依賴Rac噬菌體的ET重組系統[7]。其中,Rac噬菌體的ET重組系統編碼基因為 rec E和rec T,編碼產生的RecE蛋白具有核酸外切酶活性,能從5′端向3′端降解雙鏈DNA分子,產生3′突出端;Rec T蛋白能結合在單鏈DNA 3′突出端,防止其被單鏈核酸酶降解,同時介導互補單鏈DNA的退火。整個重組過程無需使用限制性內切酶和連接酶,僅依賴噬菌體編碼的重組酶蛋白,具有同源序列短(40～50 bp)[8],重組效率高[9-10],適用范圍廣和操作策略靈活的優勢。

盡管研究人員很早就開始應用大腸桿菌重組工程系統進行基因操作,然而對于分枝桿菌;由于其同源重組率較低,且生長緩慢,使得針對它的同源重組操作較為困難。最早有人嘗試直接利用大腸桿菌的重組工程系統進行結核分枝桿菌的基因置換,但由于分枝桿菌基因組的高 GC含量,導致大腸桿菌的這套系統不能正常行使功能。直到最近,Julia C van Kessel和 Graham F Hatfull在一種名為Che9c的分枝桿菌噬菌體中發現了類似RecE和Rec T蛋白功能的同源物——gp60和 gp61[7],它們的序列同源性接近30%,將這兩個基因構建到載體pJV 53上,并導入結核分枝桿菌細胞內,研究基因置換效率,發現在這套系統的介導下,重組效率大大提高。

與以往使用的分枝桿菌重組質粒不同,利用pJV 53質粒編碼的重組工程系統在進行基因打靶時,所需靶基因的同源片段長度在500 bp左右就可以達到很好的效果,本研究所使用的目的基因上下游同源片段長度為600 bp左右,即可將構建的敲入片段重組入恥垢分枝桿菌基因組中,遠低于傳統基因敲除所要求的超過1 000 bp的同源片段長度;且在操作中,這種方法無需使用任何特定的限制性酶切位點,即可在分枝桿菌體內完成重組過程,省去了體外酶切、連接等步驟,并能得到較高的重組效率。由此可見,這套分枝桿菌特有的重組工程系統具有傳統方法無可比擬的優越性,為今后從事分枝桿菌的遺傳操作帶來了極大的便利。

[1]van Kessel J C,Hatfull G F.Recombineering in Mycobacterium tuberculosis[J].Nat Methods,2007,4(2):147-152.

[2]Rigaut G,Shevchenko A,Rutz B,et al.A generic protein purification method for protein comp lex characterization and proteomeexp lo ration[J].Nature biotechnology,1999,17(10):1030-1032.

[3]Puig O,Caspary F,Rigaut G,et al.The tandem affinity purification(TAP)method:a general procedure of protein complex purification[J].Methods,2001,24(3):218-229.

[4]Parish T,Stoker N G.Electroporation of mycobacteria[M].Methods in Molecular Biology:Mycobacteria Protocols,1998,101:129-144.

[5]Friedman D I,Court D L.Bacteriophage lambda:alive and well and still doing its thing[J].Current opinion in microbiology,2001,4(2):201-207.

[6]Poteete A R.What makes the bacteriophage lambda Red system useful for genetic engineering:molecular mechanism and biological function[J].FEMS microbiology letters,2001,201(1):9-14.

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Knocking TAP tag in the genome of Mycobacterium smegmatismc2155 by the recombineering system in Mycobacterium

(N ational Institute for Comm unicable D isease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention/State Key Laboratory for Infectious D isease Prevention and Control,Beijing 102206,China)

ZHAO Li-li,XIA Qiang,ZHAO Xiu-qin,WAN Kang-lin

In order to knock the TAP tag in the genome of Mycobacterium smegm atis(M.smegm atis)mc2155 using the pJV 53 plasmid encoding recombineering system,pJV 53 plasmid was transformed into M.smegmatismc2155 to make the M.smegm atis mc2155 express recombinant proteins and p repare the electrocompetent cells.The tap gene was amp lified from pBS1479 plasmid and the hyg gene was amp lified from pSM T3 plasmid.The aasf(anti-anti-sigma factor)gene with AASF5 fragment(5’-noncoding region of aasf gene)and AASF3 fragment(3’-noncoding region of aasf gene)were amplified from the genome of M.smegm atismc2155.These four fragments were spliced together to form the knock-in fragment A 5THA 3 by overlap PCR.The constructed fragment was transformed into the electrocompetent cells to make it recombinant into the genome of M.smegmatismc2155.The recombinant effect was verified by PCR and DNA sequencing.The knock-in fragment of 3200bp was gotten by overlap PCR.It was confirmed by PCR and DNA sequencing that the A 5THA 3 fragment with TAP tag was knocked into the genome of M.smegm atismc2155 correctly.The TAP tag was successfully knocked into the genome of M.smegm atismc2155 and paved the way for further study of the functions of some target genes.

recombineering system;pJV 53 plasmid;tandem affinity purification(TAP)tag;knock-in fragment;overlap PCR;M ycobacterium smegmatis

R378.911

A

1002-2694(2011)06-0539-04

＊國家“十一五”重大傳染病防治科技重大專項“結核病傳播模式研究”(2008ZX100/03-010-02)資助

萬康林,Email:wankanglin@icdc.cn

1.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所/傳染病預防控制國家重點實驗室,北京 102206;2.南華大學病原生物研究所,衡陽 421001

2011-01-26;

2011-03-03