雷米普利拉和氯沙坦單用及聯用對小鼠心肌缺血-再灌注損傷的心肌保護作用比較

冉玉華，劉新友

（1.第四軍醫大學附屬唐都醫院藥劑科，西安市 710033；2.軍事醫學科學院毒物藥物研究所心血管藥理研究室，北京市 100850）

雷米普利拉和氯沙坦單用及聯用對小鼠心肌缺血-再灌注損傷的心肌保護作用比較

冉玉華1，2＊，劉新友1#

（1.第四軍醫大學附屬唐都醫院藥劑科，西安市 710033；2.軍事醫學科學院毒物藥物研究所心血管藥理研究室，北京市 100850）

目的：觀察血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）雷米普利拉與血管緊張素Ⅱ受體拮抗藥（ARB）氯沙坦單用及聯用對心肌缺血-再灌注損傷模型小鼠心肌的保護作用。方法：將32只C57BL/6小鼠隨機均分成4組，包括對照組（生理鹽水）、氯沙坦（8mg·kg－1）組、雷米普利拉（50μg·kg－1）組和氯沙坦+雷米普利拉（8mg·kg－1+50μg·kg－1）組，建立心肌缺血-再灌注損傷模型，于再灌注前5min靜脈推注給藥。術中監測相關指標如動脈血壓、左室重量/體重（LVW/BW）、危險區域/左室重量比（AR/LV）、心率等，之后處死小鼠，對組織進行染色觀察，以心肌梗死面積/危險區域（IS/AR）值作為保護心肌組織的檢測指標。結果：各組小鼠動脈血壓、LVW/BW、AR/LV和心率等無顯著性差異；雷米普利拉和氯沙坦單用及聯用組IS/AR值分別為（21.8±2.3）%、（20.8±3.2）%和（18.4±2.4）%，與對照組（39.6±2.0）%相比具有顯著性差異（P＜0.05），但單用組與聯用組比較未見統計學差異。結論：雷米普利拉和氯沙坦均對小鼠心肌缺血-再灌注損傷具有心肌保護作用，但2藥聯用作用并不優于2藥單用。

氯沙坦；雷米普利拉；心肌缺血-再灌注損傷；小鼠；心肌保護

腎素血管緊張素系統（Renin angiotensin system，RAS）在心肌缺血時被激活，使血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）合成增加，加重心肌損傷的發生。AngⅡ可以通過血管緊張素轉換酶（Angiotensin-converting enzyme，ACE）依賴性途徑和ACE獨立的途徑合成[1]。ACE抑制劑（ACEI）和AngⅡ受體拮抗藥（Angiotensin receptor blocker，ARB）通過抑制AngⅡ生物合成以及阻斷AngⅡ受體水平降低全身RAS活性，從而改善心肌梗死患者的預后[2]。近年來有研究[3，4]表明，ACEI減少缺血再灌注-損傷（IRI）后心肌梗死面積的機制與其降低內源性激肽（Kinin）的降解有關，而與AngⅡ合成無關。在動物實驗中，ACEI如雷米普利拉（Ramiprilat）[4]和ARB如氯沙坦（Losartan）[5]均可發揮藥物后適應作用，降低再灌注心肌梗死面積，而組織激肽釋放酶（Tissue kallikrenin，TK）-kinin系統可能是ACEI和ARB心肌保護作用的共同通路。比較單獨應用ACEI類藥物雷米普利拉和ARB類藥物氯沙坦及其兩者聯用是否可以發揮不同的心臟保護作用、兩者聯用是否能協同增加對抗IRI的作用在國內少見文獻報道。本實驗擬在小鼠心肌IRI的模型中，觀察雷米普利拉聯合氯沙坦對心肌的保護作用，為心臟保護的臨床藥物選用提供實驗學依據。

1 儀器、材料與方法

1.1 動物

C57BL/6小鼠，2周齡，♂，體重（25±10）g，購自維通利華動物中心，動物合格證號090814。

1.2 試藥

雷米普利拉原料藥（華海藥業股份有限公司，純度：＞99%）；氯沙坦片（默沙東制藥有限公司，規格：每片50mg）；染色劑氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）、伊文氏藍、戊巴比妥鈉均購自美國Sigma公司，純度均為化學純。

雷米普利拉和氯沙坦按照要求的濃度用生理鹽水制備成相應的溶液。

1.3 儀器

RM-6000八導生理記錄儀（日本光電株氏會社）；無創型大小鼠尾壓心率測定儀（中日友好醫院）；電子天平（德國Sartorius公司）。

1.4 分組與小鼠心肌IRI模型的建立

將32只小鼠隨機均分成4組，包括對照組生理鹽水（1μL·g－1），氯沙坦（8mg·kg－1）組，雷米普利拉（50μg·kg－1）組，氯沙坦（8mg·kg－1）+雷米普利拉（50μg·kg－1）組。再灌注前5min，靜脈推注單次給藥。氯沙坦和雷米普利拉的給藥劑量經人用臨床用藥劑量換算而得。

小鼠稱重后，戊巴比妥鈉（60mg·kg－1）腹腔注射，麻醉后氣管插管接呼吸機（潮氣量4～8mL，呼吸比5∶4，呼吸頻率90次/min），同時監測體溫并利用加熱板維持肛溫在37℃，連接八導生理記錄儀記錄心電圖變化情況，實施左側開胸術暴露心臟，移除心包，利用8.0的聚丙烯縫合線對離左心房頂端2mm處的冠狀動脈左前降支進行結扎，持續缺血30min后松開結扎處縫合線，恢復血流。左心室出現紅色血流和正常心電圖（Electrocardiogram，ECG）說明再灌注成功?；謴头尾客?，關胸，再灌注3h。

1.5 頸動脈血壓測定

小鼠建模后，保持小鼠體溫在37℃。行氣管切開術，將連接到八導生理記錄儀的導管插入左頸動脈對血壓進行監測，10min后對血壓和心率進行實時連續的記錄，并觀察比較受試藥物給予前、后1個心動周期中動脈血壓的平均值的差值，記為ΔMAP值。

1.6 小鼠生理指標的監測

包括小鼠處死前體重（Body weight，BW）、處死后檢測得到的左室重量/體重（Left ventricle weight/body weight，LVW/BW），危險區域/左室重量比（Area at risk/left ventricle，AR/LV）以及再灌注過程中心率（Heart rate，HR）的變化，記錄再灌注1、2、3h的心率值，分別記為HR1、HR2、HR3。

1.7 心肌組織學檢測

利用TTC染色劑進行病理染色。再灌注3h后，重新開胸再次阻斷冠狀動脈。5%的伊文氏藍溶液0.5mL通過頸靜脈推注進入，心肌組織中不會被伊文氏藍染色的部分稱為AR。心臟和LV先后被分離，稱重，從基底到頂端橫斷面連續切割成4片，保證第1切面在冠狀動脈閉塞處。切片用2%的TTC溶液在37℃的條件下染色20min，然后置于10%的福爾馬林溶液中浸泡24h，觀察梗死面積（Infarct size，IS，此區域不會被TTC染色），在imagine pro-plus軟件中進行成像和定量分析，可以觀察到該部分的灰度。缺血心臟組織IS重量之和與AR的絕對重量的百分比采用切片中梗死面積之和所對應的重量占所有AR切片重量的百分比表示，以此檢查藥物對心肌IRI的保護作用。

1.8 統計方法

實驗數據用均值±標準誤表示，利用Sigma stat軟件進行方差分析進行統計處理，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 動脈血壓

各組小鼠ΔMAP值結果詳見圖1。

圖1 各組小鼠動脈血壓的變化情況（n＝8）Fig1 Changes of arterial pressure in each group（n＝8）

由圖1可見，雷米普利拉組和氯沙坦組均可顯著降低小鼠動脈血壓。但是，在給藥后10～20min所記錄的ΔMAP值中，各藥物治療組與對照組相比并無統計學差異；另，2藥聯用組與2藥單用組比較，降壓效應并無顯著性差異。

2.2 生理指標

各組小鼠的BW、LVW/BW、AR/LV以及HR的變化見表1。

表1 各組小鼠生理指標檢測結果（n＝8）Tab1 Physiological index of mice in each group（n＝8）

由表1可見，各組小鼠生理指標值比較無統計學差異。

2.3 心肌組織學

各組IS/AR結果詳見圖2。

圖2 各組小鼠IS/AR比較（n＝8）與對照組比較：＊P＜0.05Fig2 Comparison of IS/AR in each grou（pn＝8）vs.control group：＊P＜0.05

圖2結果顯示，雷米普利拉和氯沙坦組小鼠IS/AR值分別為（21.8±2.3）%和（20.8±3.2）%，與對照組（39.6±2.0）%比較具有顯著差異。2藥聯合組（18.4±2.4）%雖然與對照組比較亦顯示出具有顯著的心臟保護作用，但與2藥單用組比較并無顯著性差異。

3 討論

本實驗采用結扎小鼠冠狀動脈前降支建立心肌IRI模型是研究心肌IRI的經典模型。結果各組小鼠AR/LV及心率無顯著性差異，提示實驗中模型建立具有穩定可靠、造模成功率高的優點。雷米普利拉和氯沙坦都有降低小鼠平均動脈壓的作用趨勢，但2種藥物合用并不顯著增加藥物的降壓作用，沒有統計學差異，可以推測2藥對心肌的保護作用與其降血壓作用并沒有直接的相關性，而可能涉及到其他的途徑和通路：ACEI阻斷ACE依賴性的AngⅡ合成；ARB阻斷AT1受體，可在ACEI的基礎上進一步阻斷系統RAS的活性[1]。但在IRI的心肌保護作用研究中，TK-kinin系統與ACEI和ARB的后適應作用關系更密切[5]。采用TK基因敲除小鼠，雷米普利拉[4]和氯沙坦[5]降低心肌IS的保護作用被完全阻斷。這提示TK是介導ACEI類藥和ARB類藥心肌保護作用的共同的關鍵蛋白分子。TK催化Kininogens為kinin，后者通過緩激肽B2受體可增加冠脈血流、降低心肌氧化應激等，從而發揮心肌保護作用[6]。

對于心肌IRI后心肌IS大小的測定可直接反映出心肌細胞的損傷程度和范圍。而IS/AR比值的降低則說明藥物具有保護心肌組織的能力。雷米普利拉和氯沙坦均可顯著降低心肌IS，二者具有相似的心肌保護作用，但二者聯用并沒有顯示出比單藥治療更好的心肌保護作用。依據本實驗的研究設計，尚無法對結果的相關機制予以解釋，相關研究有待進一步深入開展。ARB雖然可在ACEI的基礎上進一步阻斷系統RAS的活性，但結果表明對RAS活性的進一步抑制與阻斷AngⅡ的合成存在平行的作用關系，而不是協同效應。本實驗僅僅從ACEI和ARB類中選取了1種藥物進行比較，存在一定的局限性。然而心臟保護機制存在多種途徑和方式，從任何一個角度或者單一環節阻斷心肌梗死的病理生理進程，都會對其起到一定的保護作用，關于心肌梗死的機制和相關藥物靶點的研究開發有待繼續進行。雷米普利拉和氯沙坦作為目前臨床運用廣泛的藥物，本實驗為此2種藥物的臨床使用提供了更加廣闊的實驗治療學依據。

[1] Hollenberg NK，Fisher ND，Price DA.Pathways for angiotensinⅡ generation in intact human tissue：evidence from comparative pharmacological interruption of the renin system[J].Hypertension，1998，32（3）：387.

[2] Pfeffer MA，McMurray JJ，Velazquez EJ，et al.Valsartan，captopril，or both in myocardial infarction complicated by heart failure，left ventricular dysfunction，or both[J].The New England Journal of Medicine，2003，349（20）：1893.

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[4] Griol-Charhbili V，Messadi-Laribi E，Bascands JL，et al.Role of tissue kallikrein in the cardioprotective effects of ischemic and pharmacological preconditioning in myocardial ischemia[J].Faseb J，2005，19（9）：1172.

[5] Messadi-Laribi E，Griol-Charhbili V，Pizard A，et al.Tissue kallikrein is involved in the cardioprotective effect of AT1-receptor blockade in acute myocardial ischemia[J].The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2007，323（1）：210.

[6] Sharma JN.Role of tissue kallikrein-kininogen-kinin pathways in the cardiovascular system[J].Archives of Medical Research，2006，37（3）：299.

Protective Effect of Ramiprilat or Losartan Alone and Their Combination against Myocardium Ischemia-reperfusion Injury in Mice

RAN Yu-hua，LIU Xin-you
（Dept.of Pharmacy，Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University，Xi’an 710033，China）
RAN Yu-hua
（Dept.of Cardiovascular Pharmacology，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTIVE：To observe the protective effect of ACEI ramiprilat or ARB losartan alone and their combination against myocardium ischemia-reperfusion injury in mice.METHODS：32C57BL/6mice were randomly divided into four groups including control group（normal saline），losartan group（8mg·kg－1），ramiprilat group（50μg·kg－1）and losartan+ramiprilat（8mg·kg－1+50μg·kg－1）group.Myocardium ischemia-reperfusion injury model was established by intravenous push for 5min before reperfusion.Physiological index were monitored during the process，such as arterial pressure，LVW/BW，AR/LV and heart rate.Mice were sacrificed and brain tissue was observed by staining using IS/AR as index.RESULTS：There were no significant differences in arterial pressure，LVW/BW，AR/LV and heart rate.IS/AR of ramiprilat or losartan alone and their combination were（21.8±2.3）%，（20.8±3.2）%and（18.4±2.4）%，respectively，which is significant different from（39.6±2.0）%of control group（P＜0.05）.There was no significant difference between single therapy group and combination therapy group.CONCLUSION：Ramiprilat and losartan have protective effect against myocardium ischemia-reperfusion injury.But combination therapy is not prior to single therapy.

Losartan；Ramiprilat；Myocardium ischemia-reperfusion injury；Mice；Cardio-protection

#通訊作者：副主任藥師。研究方向：結腸靶向藥物和藥動學。電話：029-84777716。E-mail：lxylxywy@fmmu.edu.cn

R965；R972+.4

A

1001-0408（2011）17-1566-03

＊實習研究員，博士研究生。研究方向：心血管分子藥理學。電話：010-68216087。E-mail：phscyhr@tom.com

2011-01-05

2011-02-23）