埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白的原核表達及純化＊

王雪敏,王皓婷,,邱亞峰,史子學,邵東華,王水明,劉學輝,王志亮,馬志永

埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白的原核表達及純化＊

王雪敏2,王皓婷1,2,邱亞峰1,史子學1,邵東華1,王水明4,劉學輝4,王志亮3,馬志永1

目的 通過原核表達獲得埃博拉病毒科特迪瓦型的重組核蛋白,并將蛋白純化。方法將合成的埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白基因亞克隆入原核表達質粒p ET-28(a)中,構建重組表達質粒p ET-28(a)-C-NP,并將重組質粒轉化BL21(DE3)感受態細菌,以IPTG誘導蛋白表達,SDS-PAGE分析表達蛋白及表達量,并用利用 His-Band Ni+柱進行親和層析純化,Western blo t和蛋白序列分析鑒定表達蛋白。結果所構建的重組表達質粒p ET-28(a)-C-NP序列正確,SDS-PAGE檢測到目的蛋白表達,表達蛋白正確。結論成功表達并純化了埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白,為后續研究奠定了基礎。

埃博拉病毒;NP蛋白;原核表達;蛋白純化

1976年,在中非蘇丹南部和扎伊爾北部的埃博拉河流域暴發了一場大規模的出血熱,導致蘇丹284人感染,其中151人死亡;在扎伊爾導致318人感染,其中280人死亡,致死率高達88%。這種致死率極高的疾病后被命名為埃博拉出血熱(Ebola hemorrhagic fever)。埃博拉出血熱是由埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)引起的烈性人獸共患傳染病,是病死率極高的一種急性多器官出血性傳染病。

EBOV屬于絲狀病毒科(Filoviridae),與馬爾堡病毒(Marberg virus)共同構成絲狀病毒屬(Filovirus)。根據發現地點的不同EBOV共分為五種主要的亞型,即埃博拉病毒-扎伊爾型(EBOV-Z)、埃博拉病毒-蘇丹型(EBOV-S)、埃博拉病毒-萊斯頓型(EBOV-R)和埃博拉病毒-科特迪瓦型(EBOVC)[1]、以及埃博拉病毒-本迪布焦型(EBOV-B)[2]。不同亞型的毒力各不相同,其對人類毒力的強弱順序為:EBOV-Z>EBOV-S>EBOV-B>EBOV-C>EBOV-R[2-3]。其中扎伊爾型、蘇丹型、本迪布焦型、科特迪瓦型對人類有致病性,萊斯頓型僅在非人靈長類中引發疾病和死亡,人類也可能感染這種病毒從而成為無癥狀的病毒攜帶者[4-5]。目前,我國尚沒有埃博拉病毒感染或輸入的報道,但是,2009年菲利賓發生豬感染萊斯頓型病毒并傳染給人的疫情[6],我國需要高度重視,并應做好檢測和防控的技術儲備。

EBOV是單股負鏈非分節段的RNA病毒,基因組無感染性,可編碼7種蛋白,即 3’-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5’[7]。目 前,國 內 關 于EBOV感染檢測技術的研究很少,僅見以病毒VP40單克隆抗體為基礎的抗原捕獲 EL ISA方法[8]。NP蛋白是病毒核衣殼蛋白,國外學者的研究表明,NP蛋白的碳末端具有很強的抗原性,可作為抗原用于埃博拉病毒抗體的檢測[9-10]。為此,本實驗在國內首次構建了 EBOV科特迪瓦型NP基因的原核表達質粒,并表達成功,利用 His-Band Ni+柱進行親和層析純化,獲得了純化蛋白,以期為建立以NP蛋白為抗原的 EBOV感染檢測技術研究打下基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 大腸桿菌 DH 5α、BL 21(DE3)菌體、原核表達質粒p ET-28(a)、IPTG由本實驗室保存。各種限制性內切酶及各種buffer等購自寶生物公司。T4連接酶、T4連接酶所用buffer購自Invitrogen公司。普通質粒小量提取試劑盒和DNA片段回收試劑盒購自博大泰克生物技術公司,His Bank Kits蛋白質純化試劑盒購自Novagen公司,其他試劑均為國產分析純。埃博拉病毒科特迪瓦型NP基因(GenBank No.FJ217162.1)由南京金思特科技有限公司合成。1.2 實驗方法

1.2.1 基因克隆與原核表達載體的構建 科特迪瓦型NP基因在合成時已插入Bam HⅠ和 SalⅠ的酶切位點。合成基因克隆在pUC57-NP質粒中,經Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切出,利用小片段快速純化回收試劑盒對酶切產物進行回收。將酶切產物亞克隆入p ET-28(a)載體,構建 p ET-28(a)-EBOV-CNP重組質粒。將構建好的重組質粒p ET-28(a)-EBOV-C-NP,轉化感受態 E.coli DH5α,提取質粒,用Bam HⅠ和SalⅠ進行雙酶切,雙酶切產物用1%瓊脂糖電泳進行分析鑒定。

1.2.2 重組質粒的測序及目的基因的誘導表達重組質粒送往上海桑尼公司及上海英俊生物公司進行序列測定。將鑒定正確的重組表達質粒轉化感受態 E.coli BL 21(DE3),涂板挑克隆后,接種于5 mL LB(Kanr)培養基,37℃振蕩培養過夜。次日按1∶100的比例轉種,振蕩培養3h后,加入終濃度為

1.0 mmol/L的 IPTG,在37℃下誘導表達6 h。取在37℃下 IPTG誘導表達6h的菌液,以10 000 r/min轉速,4℃離心10 m in,離心后棄上清。沉淀用20m L裂解buffer重懸,于37℃振蕩裂解1h。然后超聲冰浴破菌。超聲裂解后的菌體,以12 000 r/min轉速,在4℃下離心10 min,分別收集沉淀和上清并制樣,沉淀用 20m L含 6mol/L尿素的 1×Binding buffer重懸,4℃下放置過夜。用8%SDSPA GE分析重組蛋白的表達。

1.2.3 表達產物的純化 將誘導后表達的蛋白用His-Band Ni+柱進行親和層析純化,8%SDS-PA GE檢測純化效果。

1.2.4 純化產物的Western blot分析 將收集的純化產物制樣,采用Western blot方法鑒定是否為所需目的蛋白。檢測抗體為抗兔抗EBOV扎伊爾型NP多克隆抗體,本研究室制備和鑒定。

1.2.5 純化產物的序列測定 將純化后的蛋白送往中國科學院上海生命科學研究院蛋白質組研究分析中心,采用肽碎片序列串聯質譜(M S-M S)分析技術 ,使用 4800 Plus MALD ITOF/TOF Analyzer進行序列分析。

2 結 果

2.1 p ET-28(a)-EBOV-C-NP原核重組表達載體的構建和鑒定 科特迪瓦亞型病毒NP基因全長2200bp,亞克隆入p ET-28(a)載體,對重組質粒進行Bam HⅠ和SalⅠ的雙酶切。酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析,在約2200 bp處可見特異性條帶,與預期相符(見圖1)。表明NP基因成功克隆到上述表達質粒,同時送將重組質粒送往上海桑尼公司及上海英俊生物公司進行序列測定,結果表明序列正確沒有突變。2.2 NP重組蛋白的表達 將鑒定好的p ET-28(a)-EBOV-C-NP重組質粒轉化大腸桿菌 BL 21(DE3),以終濃度 1 mmol/L的IPTG誘導6h,誘導前后樣品用8%SDS-PAGE電泳鑒定后,其分子量約為106kD,與理論計算所得分子量83.3KD有一定偏差(圖2)。

圖1 重組質粒pET-28(a)-EBOV-C-NP雙酶切鑒定Fig.1 Restricted enzymes digestion of pET-28(a)-NP plasm id M:1kb DNA maker;1:enzymes digestion of p ET-28(a)-EBOV-NP

圖2 pET-28(a)-EBOV-NP誘導前后比較Fig.2 Expression of pET-28(a)-EBOV-NP M:Proteinmarker;1:Lysateof BL21 uninduced;2:Lysate of BL21(p ET-28(a))induced with IPTG;3:Lysate of BL21(p ET-28(a)-EBOV-C-NP)uninduced;4:Lysate of BL21(p ET-28(a)-EBOV-C-NP)induced with IPTG

將用1 mmol/L IPTG誘導前后的p ET-28(a)和p ET-28(a)-EBOV-C-NP分別超聲,離心的上清和沉淀分別制樣,8%SDS-PAGE檢測表達情況。證明重組蛋白是以包含體的形式表達的(圖3)。

圖3 pET-28(a)-EBOV-NP蛋白表達形式的鑒定Fig.3 Analysis of expression of pET-28(a)-EBOV-NP M:Protein marker;1:Lysate of BL21 uninduced;2:Lysateof BL21(p ET-28(a))induced with IPTG;3:Lysate of BL21(p ET-28(a)-EBOV-C-NP)uninduced;4:Lysate of BL 21(p ET-28(a)-EBOV-CNP)induced with IPTG;5:supernatant of BL21(p ET-28(a)-EBOV-C-NP);6:pellet of(p ET-28(a)-EBOV-C-NP)

2.3 NP重組蛋白的純化 將超聲裂解后離心的沉淀用含6mol/L尿素的1×Binding buffer重懸過夜后,用 His-Band Ni+柱進行親和層析純化,8%SDS-PAGE檢測純化結果(圖4)。

2.4 純化產物的Western blot分析為了鑒定所表達的重組蛋白,對重組蛋白分別使用 His抗體和抗EBOV扎伊爾型的NP蛋白多克隆抗體進行Western blot分析,顯色后出現特異性的蛋白條帶,證實了EBOV科特迪瓦型NP重組蛋白獲得了正確表達(圖 5)。

圖4 NP重組蛋白的純化Fig.4 Purification of NP recombinant protein M:Protein marker;1:purification of NP recombinant protein

圖5 NP重組蛋白的Western blot鑒定Fig.5 Identification of NP recombinant protein by Western blot 1:Lysate of BL21(p ET-28(a)-EBOV-C-NP)induced with IPTG;2:Purification of NP recombinant protein3:Lysate of BL21(p ET-28(a)-EBOV-C-NP)uninduced

2.5 純化重組蛋白的序列測定 為了進一步驗證NP重組蛋白,將純化的重組蛋白采用肽碎片序列串聯質譜分析技術進行氨基酸序列分析,所檢測出的13個肽段序列經NCB IBLAST分析表明,純化蛋白為埃博拉病毒科特迪瓦型核蛋白。

3 討 論

埃博拉病毒有著極強的感染性,致死率極高,可達50%～90%[11]。對人類的生命健康安全危害很大。世界衛生組織已將埃博拉病毒列為對人類危害最嚴重的病毒之一。尤其在恐怖活動日益增多的當今社會,不排除EBOV被用作生化武器的可能。應該引起我們的高度重視,著手于早期防控工作[12]。

埃博拉病毒的NP、VP40和 GP蛋白是檢測EBOV感染技術研發的主要候選蛋白。我國已有以病毒 VP40單克隆抗體為基礎的抗原捕獲EL ISA方法的報道[8]。NP蛋白為 EBOV的核衣殼蛋白質,其基因定位在基因組的3’末端,被一個前導序列所引導,編碼區長大約2 217個堿基,編碼一個含738個氨基酸的蛋白質[13]。NP具有很好的抗原性,國外已經建立了基于NP單克隆抗體的用于檢測扎伊爾型、蘇丹型、萊斯頓型病毒的抗原捕捉EL ISA方法[9]。由原核表達得到的重組NP蛋白具有良好的抗原性,并且沒有感染性,可用于檢測病毒特異性抗體[10]。

NP蛋白的保守性較高,抗原區域主要集中在361-464位氨基酸和630-738位氨基酸之間,可被4種亞型 EBOV的抗體所識別[9]。以扎伊爾型病毒重組NP為抗原制備的單克隆抗體,不僅可識別扎伊爾型病毒的NP蛋白,還可識別蘇丹型和萊斯頓型病毒的NP蛋白,還可能與科特迪瓦型的NP反應[14]。我們實驗室所制備的抗扎伊爾型病毒NP多克隆抗體同樣能識別蘇丹型、萊斯頓型和科特迪瓦型病毒的NP(未發表數據)。因此,制備重組NP蛋白能為埃博拉病毒檢測和診斷提供重要的基礎材料。

本研究發現原核表達的重組NP蛋白的分子量約為106kD,與理論計算所得分子量83.3kD有一定偏差(圖2)。但是,Western blo t和蛋白序列質譜分析表明所表達的重組蛋白為目的蛋白。出現分子量大小偏差的原因可能為:在NP蛋白羧基端上的439-492位氨基酸和589-738位氨基酸兩段區域為酸性區域,區域內存在的絲氨酸和蘇氨酸可影響蛋白的遷移率,會對蛋白的正常遷移產生影響,使得SDS-PAGE鑒定所得分子量大于計算所得分子量。另外,NP蛋白可以和很多外源凝集素相互作用,以及翻譯后修飾都是影響NP蛋白遷移率的原因[15]。

埃博拉病毒屬于高危險病毒,需要在生物安全4級實驗室操作。我國尚無埃博拉病毒,為此,我們根據 GenBank公布的NP基因序列,采用基因合成技術合成了 EBOV科特迪瓦型NP基因,解決了沒有病毒基因的問題。通過構建原核表達質粒,并在大腸桿菌內進行了表達和純化,表達蛋白可被特異性抗體所識別,具有良好的抗原性。現已研究證明,抗原捕獲 EL ISA、競爭性 EL ISA等方法,既可檢測埃博拉病毒抗原,也可檢測特異性 IgM和 IgG抗體[16-17]。本實驗制備的重組蛋白為埃博拉病毒的檢測打下了良好的基礎。

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Prokaryotic expression and purification of nucleoprotein gene of Ebola virus C?te d’Ivoire type

WANG Xue-min,WANG Hao-ting,Q IU Ya-feng,SH IZi-xue,SHAO Dong-hua,WANG Shui-ming,L IU Xue-hui,WANG Zhi-liang,MA Zhi-yong

(Department of Veterinary Public Health,Shanghai Veterinary Research Institute,Chinese Academ y of A gricultural Sciences,Shanghai 200241,China)

To obtain recombinant protein of the nucleoprotein(NP)of Ebola virus C?te d’Ivoire type using p rokaryotic expression system,the synthesized NP gene was sub-cloned to generate p ET-28(a)-C-NP recombinant plasmid,which was then transformed into E.coli BL21(DE3)competent bacteria.The expression of NP recombinant protein was induced by IPTG and analyzed by SDS-PAGE.The expressed protein was purified using His-Band Ni+affinity chromatography and identified by Western blot and protein sequencing.The recombinant expression plasmid p ET-28(a)-C-NPwas obtained and the recombinant NP protein was expressed and purified.The obtained NP protein was confirmed by Western blot and protein sequencing.These results demonstrate that the NP recombinant protein was expressed and characterized.In conclusion,successfully expressed and purified Ebola virus nucleoprotein type C?te d’Ivoire aid the foundation for the follow-up study.

Ebola virus;NP protein;p rokaryotic expression;protein purification

R373.9

A

1002-2694(2011)07-0601-04

＊公益性行業(農業)科研專項(200903037-06)和江蘇出入境檢驗檢疫局項目(2011KJ03)資助

馬志永,Email:zhiyongma@shvri.ac.cn

1.中國農業科學院上海獸醫研究所獸醫公共衛生研究室,上海 200241;2.河北工程大學農學院,邯鄲 056001;3.中國動物衛生與流行病學中心,青島 266114 4.南京出入境檢驗檢疫局

2010-11-08;

2011-02-19