禽流感(H5+H9)二價滅活疫苗對珍禽的免疫效果觀察*

李興玉,王 強,楊曉梅,牛李麗,謝 晶,余建秋,廖黨金,余星明,林 毅,鄧家波

禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起禽類(家禽和野禽)的一種危害嚴重的傳染病。高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)可引起禽類大批發病死亡,也可引起人類感染死亡,世界動物衛生組織(OIE)將其列為A類傳染病,我國也將高致病禽流感列為一類重大動物疫病。目前流行于中國大陸的禽流感病毒主要血清型是H5亞型和H9亞型,H5亞型禽流感病毒是主要的高致病性毒株,可引起禽類大批急性發病死亡;H9亞型禽流感病毒多為低致病性毒株,主要引起產蛋下降或呼吸道癥狀。近年來,禽流感在野生鳥類、動物園珍禽中也有暴發的情況[1-2],不僅加大了珍禽保護的難度,同時也對動物園的游客和工作人員健康造成了一定威脅。因此研究適用于珍禽禽流感的免疫技術不僅關系到珍禽保護工作,也關系到公共衛生安全。目前我國沒有專門用于珍禽的禽流感疫苗,珍禽禽流感的防控只能使用家禽禽流感疫苗。但關于家禽禽流感疫苗用于珍禽的安全性及免疫效果國內外研究報道的較少,因此本實驗對成都動物園的多種珍禽進行了家禽禽流感(H5+H9)二價滅活疫苗的免疫試驗,并定期采血檢測其血清中HI抗體效價,評價免疫效果,為制定珍禽的禽流感免疫技術提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗疫苗 禽流感(H5+H9)二價滅活疫苗,批號:2009008,哈爾濱維科生物技術開發公司生產。

1.1.2 試驗動物 成都動物園圈養的15種珍禽(孔雀、原雞、白鷴、七彩山雞、藍馬雞、白冠長尾雉、東方白鸛、丹頂鶴、禿鷲、綠頭鴨、黑天鵝、斑頭雁、黃鴨、鴛鴦、鸚鵡)。

1.1.3 檢測試劑 禽流感H5亞型抗原、陽性血清(批號分別為 200901、200801);禽流感H9亞型抗原、陽性血清(批號分別為07102101、080305),均購自哈爾濱維科生物技術開發公司。

1.1.4 1%紅細胞懸液 采集3只SPF公雞血液與等體積阿氏液混合,用pH值7.2的0.01mo1/L PBS液離心洗滌3次,洗滌后用PBS液配成體積分數為1%紅細胞懸液。

1.2 方法

1.2.1 免疫 用禽流感疫苗免疫成都動物園圈養的15種珍禽,根據品種、年齡的不同,分別于胸肌或頸部皮下注射0.3-1.0mL/羽,所有免疫珍禽都套上腳標,做好編號。

1.2.2 血清采集 分別在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d翅靜脈采血,待血清析出后,8 000r/min離心4min,吸出血清并編號,-20℃冰箱保存備用。

1.2.3 抗體檢測 參照《高致病性禽流感診斷技術》(GB/T 18936-2003)所規定的方法,分別用禽流感H5亞型和H9亞型HI標準抗原,進行免疫抗體水平檢測。

1.2.4 結果判定 以完全抑制4個血凝單位抗原的血清最高稀釋倍數作為HI效價,只有陰性對照孔效價不大于2 log2,陽性對照孔效價誤差不超過1個log2時,試驗結果才有效。參照農業部發布的農業行業標準《高致病性禽流感—免疫技術規范》,禽流感HI效價4 log2判為免疫合格。

2 結 果

2.1 用禽流感(H5+H9)二價滅活苗免疫動物園圈養的15種珍禽后,其飲水、采食及精神狀態均正常。

2.2 15種珍禽群體H5亞型禽流感HI抗體平均水平在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d分別為1.92 log2、4.90 log2、7.21 log2、5.80 log2 和 5.02 log2;H5亞型抗體合格率在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d 分別為 25%、62.29%、91.67%、70.83%和70.83%,H5亞型禽流感抗體水平在21d達到高峰,35d時抗體水平已開始下降,其中七彩山雞、丹頂鶴、黃鴨平均抗體水平已下降到4 log2以下。孔雀、原雞、白鷴、斑頭雁等產生抗體水平較好,而白冠長尾雉、黃鴨等產生抗體較差,鴛鴦始終沒有檢測出H5亞型抗體。結果詳見表1。

2.3 15種珍禽群體H9亞型禽流感HI抗體水平在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d分別為2.06 log2、7.73 log2、7.65 log2、7.10 log2 和 6.38 log2,H9亞型抗體合格率在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d 分別為 29.17%、95.83%、95.83%、91.67%和85.42%,H9亞型抗體水平在免疫后14d達到高峰,到90d群體抗體水平均維持在6 log2以上。孔雀、原雞、白鷴、斑頭雁等產生抗體水平較高,而白冠長尾雉、鴛鴦、鸚鵡等產生抗體較差。結果詳見表2。

表1 免疫珍禽H5亞型禽流感HI抗體檢測結果

表2 免疫珍禽H9亞型禽流感HI抗體檢測結果

3 討論與分析

3.1 當前疫苗免疫仍然是禽流感防制的主要措施。國內目前沒有專門用于珍禽的禽流感疫苗,珍禽禽流感防控是采用家禽疫苗,而家禽疫苗用于珍禽免疫的安全性和免疫效果國內僅有零星的研究報道,由于試驗樣本及試驗條件的差異,各家得出的結論也不盡一致[3-8]。有些珍禽如東方白鸛、綠頭鴨、白冠長尾雉等國內尚無研究報道。本次試驗采用禽流感(H5+H9)二價滅活苗對動物園圈養的15種珍禽進行免疫,免疫試驗期內,未出現免疫副反應,可見家禽禽流感疫苗用于珍禽免疫是安全的,這與梁少良、吳艷云等人的報道是一致[3,5]。

3.2 免疫的15種珍禽(除鴛鴦外)都能同時產生H5和H9亞型HI抗體。珍禽群體H5亞型HI抗體免疫后14d即可達到4.9 log2,免疫后21d達到高峰,為7.21 log2,孔雀、原雞、白鷴、斑頭雁等產生抗體水平較好,而白冠長尾雉、黃鴨等產生抗體較差,鴛鴦始終沒有檢測出H5亞型抗體;H9亞型HI抗體14d達高峰,為7.73 log2,之后能維持較長的時間,孔雀、原雞、白鷴、斑頭雁等產生抗體水平較高,而白冠長尾雉、鴛鴦、鸚鵡等產生抗體較差。試驗結果比吳艷云、梁少良和姜北宇等人報道的免疫效果更好[3-5],這可能與免疫的珍禽的品種、免疫劑量以及免疫前動物群體的基礎抗體水平有關。試驗過程中還發現東方白鸛不同個體對禽流感(H5+H9)二價滅活苗的不同亞型抗原的免疫應答反應差別較大,免疫的三只東方白鸛中有兩只產生了H5亞型禽流感HI抗體和H9亞型禽流感HI抗體,有一只卻只產生了H9亞型禽流感HI抗體;兩只鸚鵡也是對禽流感(H5+H9)二價滅活苗的不同亞型抗原的免疫應答反應差別很大,兩只鸚鵡沒有產生H5亞型禽流感HI抗體,卻能產生較好的H9亞型禽流感HI抗體。出現上述現象的原因還有待進一步研究。

3.3 本次試驗在國內首次應用禽流感(H5+H9)二價滅活疫苗對動物園圈養珍禽進行免疫試驗研究,其中對東方白鸛、綠頭鴨、白冠長尾雉的免疫研究在國內屬首次報道,試驗結果對制定國內動物園珍禽禽流感免疫技術具有重要的借鑒意義。

3.4 現已證實禽流感病毒廣泛分布于世界范圍內的許多家禽和多種鳥類,覆蓋22科88種,其中主要有雁形目、鸻形目、雀形目中野鳥。各種野鳥尤其是野生水禽是禽流感病毒的主要儲存宿主,所有16種HA亞型(除H13亞型病毒僅在海岸鳥和鷗類中發現)和9種NA亞型的病毒都可以在野生水禽中分離出[9-11]。動物園是各種鳥類聚集的地方,也是人類與珍禽接觸的主要場所,各種鳥類的匯聚為禽流感病毒的基因重排及基因變異創造了有利環境,增加了禽流感流行的風險,因此做好禽流感的防控工作可以有效保護動物園的珍禽,同時對公共衛生安全具有重要意義。此次珍禽禽流感二價疫苗免疫試驗表明,大部分珍禽能產生較好的免疫反應,但品種間,品種內個體間珍禽對疫苗的免疫應答反應差別較大。因此,對動物園珍禽禽流感的防控除應切實做好疫苗免疫接種工作,并定期監測抗體水平,對抗體水平低的珍禽及時加強免疫,從而有效降低其易感性;同時,動物園還應做好消毒工作,尤其是對于外來野鳥飛入動物園內部停靠的地點應加強消毒工作。此外,還應加強動物園野生動物的疫病監測,對于剛引進的珍禽還應做好檢疫、隔離工作。總之,對動物園珍禽禽流感的防控須采取綜合防控措施。

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