DIGFA-kit和IEST檢測人、鼠斯氏貍殖吸蟲抗體的研究*

朱名勝,朱 敬,王紹基,宋明華

斯氏貍殖吸蟲病(Pagunogonimiasis skrjabini)的病原體為斯氏貍殖吸蟲(Pagumogonimus skrjabini),是在中國廣泛分布,危害嚴重的食源性寄生蟲病。湖北省十堰市曾在蟹體內查出斯氏貍殖吸蟲囊蚴,在貓、犬體內也檢出過斯氏貍殖吸蟲成蟲[1],因當地居民有飲生水和食生蟹的習慣,斯氏肺吸蟲病病人時有發現[2]。由于人體為該蟲的非正常宿主,感染后導致“幼蟲移行癥”引起多組織、器官的損害,嚴重危害其身體健康[3-4],該病臨床表現復雜多樣,常被誤診、誤治。為了探索較簡易的血清學診斷方法,作者采用肺吸蟲病金標滲濾試劑盒(DIGFA-kit)和免疫酶染色試驗(IEST)對流行區人群和斯氏貍殖吸蟲感染鼠血清進行特異性抗體檢測,比較二者的敏感性和特異性。

1 材料與方法

1.1 試劑盒 肺吸蟲病抗體快速檢測(金標滲濾法)試劑盒(浙江省醫學科學院提供)。

1.2 血清樣本 斯氏貍殖吸蟲病流行區湖北省十堰市居民血清1 062份,感染斯氏貍殖吸蟲90d大鼠血清40份(每鼠感染囊蚴30個),感染旋毛蟲50d大鼠血清34份,感染日本血吸蟲40d家兔血清30份,蛔蟲病人血清28份,健康大鼠血清40份。其中40只實驗大鼠感染后每周心臟穿刺取血1次,分離血清備用。

1.3 冰凍切片抗原制備 剖殺經人工感染斯氏貍殖吸蟲 3個月的犬,從肺蟲囊中收集成蟲,用0.01mol/L pH7.4 PBS(含 0.05%Tween20)沖洗后,冰凍切片,厚度 6μ m,每張載玻片裱貼5塊抗原片,經丙酮固定后,-20℃保存備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 DIGFA 取試劑盒置一平面上,加洗脫液1滴(100μL),使加樣孔上 NC 膜濕潤;加待檢血清25μL,待滲入;加洗脫液 1 滴(100μL),洗去未結合抗體;加膠體金-羊抗人IgG標記物1滴(100μL),待滲入;加洗脫液2滴(200μL),滲入后肉眼判斷結果。中央圓孔NC膜上出現了紅色圓點為陽性;未出現紅色圓點,僅留白色或淡紅色背景為陰性。

1.4.2 IEST 將測試血清用0.01mol/L pH7.4 PBS分別作1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀釋,分別取1滴滴于斯氏貍殖吸蟲成蟲冰凍切片上,置濕盒中35℃孵育60min,用0.01mol/L pH7.4 PBS洗滌3次,每次5min,吹干。滴加酶標葡萄球菌蛋白A(HRP-SPA,北京生物制品研究所產品,工作濃度1∶20),同上培育洗滌。再加底物溶液(3,3-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽-過氧化氫),室溫反應15～20min,棄底物,用蒸餾水速洗,將濕片置光鏡下觀察反應。結果判定:抗原片不著色為(-);呈淡棕色為(+);棕色為(++);棕褐色為(+++)。陽性反應標準定為血清稀釋度≥1∶10(+)。

2 結 果

2.1 特異性 斯氏貍殖吸蟲流行區人群及斯氏貍殖吸蟲病鼠血清DIGFA和IEST的陽性檢出率均為5.08%和100%,其它對照血清除1例血吸蟲病兔DIGFA出現陽性反應外,均為陰性(表1)。

2.2 敏感性 40只大鼠感染后不同時間二種方法檢測結果見表2,二種方法感染后第1周血清抗體均為陰性,從第2周開始出現陽性,第4周陽性率達100%,持續至第 8周。

表1 DIGFA和IEST檢測血清斯氏貍殖吸蟲抗體結果Table 1 Result of detection for antibody test of human in endemic area and animals with different parasitic diseases by DIGFA and IEST

表2 大鼠感染斯氏貍殖吸蟲后血清抗體檢測結果(DIGFA和IEST)Table 2 Results of detection for antibody in serafrombig rats infected with Pagumogonimus skrjabini

3 討 論

斯氏貍殖吸蟲是一種人獸共患寄生蟲,一般在人體內不能發育為成蟲,病原學診斷較為困難。免疫學診斷常用的方法主要是皮內試驗,皮內試驗方便、快速,但具有一定的交叉反應,特異性不強。滴金免疫(金標)滲濾法(DIGFA)是一種新近發展起來的免疫標記技術,近年來報道應用衛氏并殖吸蟲成蟲抗原(PwA)金標滲濾試劑盒(DIGFA)檢測同源肺吸蟲病病人血清抗體敏感性可達98.8%和98.9%,特異性可達93.0%和94.8%[5-6],證明應用于衛氏肺吸蟲病流行地區具有敏感性高,特異性強,操作簡便、快速,不需要特殊設備等優點,適用于臨床檢驗和現場應用。湖北省十堰地區為斯氏肺吸蟲病流行地區,本次用DIGFA和IEST檢測流行區居民和病鼠血清抗體,陽性率均為5.08%和100%。表明這兩種方法用于斯氏肺吸蟲病的檢測均具有較好的敏感性和特異性,在斯氏肺吸蟲病抗體的檢測中,不僅為較好的手段,而且這兩種方法彼此間檢測結果呈較好的一致性,并均具有早期診斷價值。

李調英等[7]報道衛氏肺吸蟲成蟲抗原(PwA)和斯氏貍殖吸蟲成蟲抗原(PsA)對同源及異源肺吸蟲病人血清反應都有較好的敏感性和特異性。作者應用PwA抗原制備的DIGFA試劑盒檢測斯氏貍殖吸蟲病流行地區人群血清,斯氏肺吸蟲大鼠血清和其它對照血清,檢測結果與IEST試驗結果基本一致。說明Pw和Ps有很多共同的特異抗原組份,決定了它們能與異源肺吸蟲病人血清IgG有效的特異結合。

實驗結果表明,肺吸蟲病DIGFA診斷試劑盒和IEST用于斯氏肺吸蟲病血清學檢測具有簡便、快速、敏感性和特異性較好,結果易于判斷等優點。因此,在斯氏肺吸蟲病流行地區進行臨床診斷和流行病學調查時,可選用其中一種方法,作為病原學診斷的替代方法,上述二種血清學試驗方法均具有較大的實用價值。

[1]張光玉,郭鄂平.十堰地區肺吸蟲病區域分布及流行病學[J].鄖陽醫學院學報,1997,16(1):23.

[2]朱名勝,朱丹.斯氏肺吸蟲病 108例臨床報告[J].四川醫學,2004,25(12):1321.

[3]郭鄂平,朱潔,張光玉,等.斯氏貍殖吸蟲病53例臨床資料分析[J].山西醫科大學學報,2008,39(2):147-149.

[4]Nakamura-uchiyama F,Onah DN,Naway MV.Clinical features of paragonimiasis cases recently found in Japan:parasite-specific immunogobulin M and G antibody classes[J].Clin Infect Dis,2001,32(2):171-175.

[5]干小仙,施曉華,王越,等.肺吸蟲病抗體快速檢測試劑盒(金標滲濾法)的研制和應用[J].中國人獸共患病雜志,2005,21(11):988-990.

[6]丁建祖,王越,陳軍虎,等.斑點金免疫滲濾法檢測肺吸蟲抗體的評價[J].中國人獸共患病雜志,2003,19(1):89-90.

[7]李調英,徐亮,曾明安.衛氏和斯氏肺吸蟲抗原對同源及異源肺吸蟲病診斷價值的比較[J].實用寄生蟲病雜志,2000,6(2):86-87.