PCR檢測細菌16 s rRNA基因在臨床感染性疾病診斷中的應用

王蒙 徐志毅 高斐 馮星 錢麗娜 施錦

PCR檢測細菌16 s rRNA基因在臨床感染性疾病診斷中的應用

王蒙 徐志毅 高斐 馮星 錢麗娜 施錦

目的建立檢測臨床常見細菌16 s rRNA基因的PCR方法。方法分析細菌16 s rRNA基因保守區，設計通用引物對7種常見細菌16 s rRNA基因進行PCR擴增;并用該方法檢測臨床血液標本中的16 s rRNA基因表達，與傳統培養方法結果進行比較。結果7種標準菌株均出現特異陽性條帶;感染性疾病血液標本16 s rRNA基因陽性表達。結論16 s rRNA基因PCR法可用于快速檢測臨床細菌感染。

聚合酶鏈反應;細菌;感染;16 s rRNA基因

快速、準確檢測出機體內存在的病原菌是臨床診斷細菌性感染疾病的重要指標，對疾病的及時、有效治療具有重大意義。傳統的檢測方法主要使用常規細菌培養，一般所需時間長，且陽性率不高，因此嚴重影響了疾病的診治。應用聚合酶鏈反應(PCR)法檢測細菌感染，具有快速、準確和特異的優點，利于對疾病的快速診斷和及時治療。本研究建立了細菌16 s rRNA基因的PCR檢測方法，旨在提高感染性疾病的檢出率，以適應現代臨床的需要。

1 材料與方法

1.1 材料 7種標準菌株(大腸埃希菌、產氣腸桿菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌、傷寒沙門菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌)由本課題組教研室保存;臨床血液標本40例，包括檢查確診的感染性病患血液標本30例與健康者血液標本10例。Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA marker等均購自大連寶生物公司，引物由上海生工公司合成。ASTEC PCR擴增儀(PC-818)，SYNGENE 凝膠成像系統(G:BOX)，Eppendorf高速離心機(5415R)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 采用細菌16 s rRNA基因高保守區設計通用引物，上游引物 F:5'-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3'，下游引物R:5'-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3'，擴增產物長度為371 bp。

1.2.2 16 s rRNA基因的獲取 挑取單個菌落，加入50μl抽提裂解液，100℃煮沸10 min，12000 r pm離心 5 min，取上清作為PCR擴增模板;抗凝血液標本以500 rpm離心5 min，取血漿50μl，加入50μl抽提裂解液，處理步驟同上。

1.2.3 PCR擴增 將標準菌株進行PCR擴增建立檢測體系，PCR體系如下:模板2μl;上下游引物各1μl;10×Taq buffer(Mg2+plus)5μl;dNTPs Mix(10mmol/L)1μl;Taq酶(5 U/μl)0.5μl;ddH2O 39.5 μl;反應體系總量為50μl。PCR反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，30個循環;最后于72℃延伸5 min。以同樣PCR體系條件擴增檢測臨床血液標本，將標準菌株作為陽性對照，并與傳統培養方法結果進行對比。

2 結果

2.1 標準菌株16 s rRNA基因擴增結果 取5μl PCR擴增產物于1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，以DNA marker DL2000作標準分子量，用凝膠成像系統觀察電泳結果，見圖1。PCR擴增后各菌株均在370 bp附近出現特異的目的片段，與預計的片段大小吻合。

2.2 臨床血液標本16 s rRNA基因擴增結果 血液標本PCR擴增結果見圖2。臨床確診的細菌感染病患血液標本均出現陽性片段，擴增的條帶與陽性對照標準菌株(大腸埃希菌)的條帶片段大小一致;而健康者血液標本與ddH2O的陰性對照結果未出現特異性條帶。

2.3 PCR法與傳統培養法檢測結果對比 對40例臨床血液標本分別進行細菌學培養與PCR檢測，其中10例健康者血液標本經兩種方法檢測均為陰性。30例確診感染的病患標本經培養檢測14例大腸桿菌陽性、12例金黃葡萄球菌陽性、4例陰性，陽性檢出率86.7%;培養法檢出的26例陽性標本經PCR檢測全部為陽性，另有2例培養呈陰性的標本經PCR檢測后也呈陽性，陽性檢出率達93.3%。雖兩者比較未顯示統計學顯著性差異(P＞0.05)，仍表明了PCR法的檢出率有高于傳統培養法的趨勢。

圖1 (左)7種標準菌株16 s rRNA基因片段PCR擴增結果圖2 (右)臨床血液標本16 s rRNA基因片段PCR擴增結果

3 討論

有關感染疾病的診斷問題是當前臨床研究中的重點，引起感染的病原菌種類繁多，如何快速獲知為何種病原體感染，是臨床實驗室檢驗迫切需要解決的問題。一些致病菌的培養周期過長、分離技術復雜以及使用抗生素治療等都會導致細菌培養檢測面臨困難［1］，并且對于大量使用過抗生素的臨床標本，傳統方法更不實用。隨著現代分子生物學技術的發展，以細菌16 s rRNA基因序列為基礎建立的PCR方法能夠快速、準確地檢測臨床標本中病原菌的感染。此種方法可早期判斷細菌感染的存在［2］，并通過對擴增產物的進一步分析可對病原菌的種屬作出鑒定，因而彌補了上述檢測方法的不足，是感染性疾病診斷的一個重要突破口。

細菌的16 s rRNA基因序列具有高度保守性，被稱為細菌的“分子化石”［3］。本研究分析細菌16 s rRNA基因保守區并設計通用引物，通過PCR方法擴增各種細菌的16 s rRNA基因片段，370bp處獲得特異性條帶。對于正常情況下無菌的組織和體液標本(如血液、腦脊液等)，只要檢測出16 s rRNA基因片段的特異性表達，即確定有細菌感染。此種方法受抗生素影響小，無需在用藥前抽血［4］，整個PCR擴增僅4～6 h即可完成，完全滿足臨床快速診斷的要求。因此與傳統的感染性疾病診斷方法相比，具有高效、準確、特異性強的優點，可診斷早期的細菌感染，為治療提供寶貴時機。

本研究對PCR快速檢測臨床感染疾病的體系建立進行了初步探討。因16 s rRNA基因只存在于原核生物，不存在于病毒、真菌等非原核生物體內［5］，故此方法只對于細菌性感染疾病的初步檢測具有臨床指導意義;而且對細菌種屬的鑒定還需進一步分析，如序列測定等。另外，PCR操作過程中易因污染導致假陽性結果［6］，因此實驗中應嚴格規范無菌操作，并設立陰性對照，由此提高檢測結果的正確性和可靠性。

［1］Su WQ，Ji YC，Jiang Y.Application of the 16 s rRNA gene assay in clinical bacterial identification.World Journal of Infection，2005，5(1):79-81．

［2］Zhang F，Song L.Progress about the detection of 16 s rRNA gene in the diagnosis of neonatal septicemia.Medical Recapitula，2006，12(17):1035-1037．

［3］Hoffmann M，Brown EW，Feng PC，et al.PCR-based method for targeting16 s-23 s rRNA intergenic spacerregions among Vibrio species.BMC Microbiology，2010，10:90．

［4］Jordan JA，Durso MB.Comparison of 16 s rRNA gene PCR and BACTEC 9240 for detection of neonatal bacteremia.Clin Microbiol，2000，38(7):2574-2578．

［5］Li X，Gao Q.The application of the16 s rRNA gene assay in clinicalmicrobiology.Journal of Microbes and Infection，2006，1(3):184-186．

［6］Carroll NM，Jaeger EE，Choudhury S，et al.Detection of and Discrimination between Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria in Intraocular Samples by Using Nested PCR.Clin Microbiol，2000，38(5):1753-1757．

上海高校選拔培養優秀青年教師科研專項基金(項目編號:yyz08001)

201318上海醫藥高等專科學校檢驗系