基于譜效相關(guān)的多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法優(yōu)選生地黃的提取工藝

郭東艷，張麗娟，師延瓊，王梅

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院陜西咸陽(yáng)712046;2.陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑中心陜西咸陽(yáng)712000)

生地黃湯來(lái)源于《千金方》，由生地黃和大黃兩味藥組成，用法:生地黃煎汁，生大黃為沫沖服［1］。依據(jù)臨床應(yīng)用與生地黃止血作用的活性部位［2-3］，有必要對(duì)生地黃的提取工藝進(jìn)行相關(guān)研究，同時(shí)根據(jù)其止血作用活性部位的篩選，考慮到活性部位主要為一些極性較大的部位［4-5］，因此擬選擇以水作為提取溶媒，并針對(duì)影響水提的主要因素藥材加水量、浸泡時(shí)間及煎煮時(shí)間3個(gè)因素，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以樣品中多糖量、各指紋峰相對(duì)于梓醇量的加和為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分［6-11］，優(yōu)選最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters高效液相色譜儀(Waters2695 Separations Module，Waters2996 DAD檢測(cè)器)含在線真空脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱。可見(jiàn)—紫外分光光度儀(UV-1102，上海天美科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑生地黃(西安盛興中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào):090701，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院生藥教研室王繼濤老師鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥塊根);95%乙醇(安徽安特生物化學(xué)有限責(zé)任公司，分析純);濃硫酸(西安三浦精細(xì)化工廠，批號(hào):081020);蒽酮(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):Lot.NO20061108);梓醇對(duì)照品(批號(hào)110808-200407，供定量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所);乙腈為色譜純;水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定

2.1.1 多糖量測(cè)定［2］供試品溶液的制備將單因素實(shí)驗(yàn)1～4號(hào)樣品及正交實(shí)驗(yàn)1～9號(hào)樣品，分別加95%乙醇使含醇量達(dá)到80%，加蓋放置24 h。保留上清液。將醇沉淀物加水溶解，至50 mL量瓶。將各樣品分別在622 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖量。

2.1.2 樣品中各指紋峰相對(duì)于梓醇量的測(cè)定

2.1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性色譜柱:Akasil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相:乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，0～5 min A由0.3%升至1%，5～10 min 1%升至2.6%，10 min～16 min 2.6%，16～32 min A由2.6%升至8%，32～40 min A由8%升至15%，40 min～60 min A由15%升至30%;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;柱溫:30℃;體積流量:1 mL/min。

2.1.2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取梓醇對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成每1 mL約含0.28 mg的溶液，搖勻，即得。

2.1.2.3 供試品溶液的制備用2.1.1項(xiàng)供試品溶液制備中的上清液，回收乙醇至無(wú)醇味，蒸干，用水定容于50 mL量瓶，取3 mL水浴蒸干，加流動(dòng)相定容于10 mL量瓶。0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.4 指紋峰定量分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，選擇保留時(shí)間固定，達(dá)到基線分離的指紋峰，記錄峰面積，以基準(zhǔn)峰梓醇為依據(jù)，計(jì)算每個(gè)指紋峰的相對(duì)含量。樣品指紋圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 樣品的HPLC指紋圖譜

2.2 單因素試驗(yàn)考察生地黃的提取次數(shù)樣品溶液的制備:稱取生地黃藥材約50 g，加8倍量水，浸泡30 min，分別提取1次，2次，3次，4次，每次1 h。以樣品中多糖量、各指紋峰相對(duì)于梓醇量的加和為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選提取次數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1中可以看出，提取1次，2次，3次時(shí)多糖量及各指紋峰相對(duì)梓醇量增加較大，提取4次時(shí)多糖量及各指紋峰相對(duì)梓醇量增加不大，表明已基本完全，因此確定提取次數(shù)為3次。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合水提工藝的主要影響因素藥材浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間3個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，按照L9(34)正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)。以樣品中多糖量、各指紋峰相對(duì)于梓醇量的加和為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選最佳提取工藝參數(shù)。因素水平見(jiàn)表2。

表1 單因素篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.3.1 正交試驗(yàn)樣品溶液制備稱取生地黃藥材共9份，每份約50 g，按表3中L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案進(jìn)行加水，浸泡，煎煮提取，提取液濾過(guò)，濃縮至50 mL，即得各樣品液。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)生地黃止血作用的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出其有效部位可能是糖類、環(huán)烯醚萜苷類，故選擇多糖量、樣品中各指紋峰相對(duì)于梓醇量的加和為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析。根據(jù)各指標(biāo)對(duì)提取工藝影響的貢獻(xiàn)大小給予不同的權(quán)重系數(shù)，即多糖的量為0.4，樣品中指紋峰相對(duì)于梓醇量的加和為0.6，進(jìn)行加權(quán)求和，結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析見(jiàn)表4。

2.3.3 結(jié)果分析以綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，由表3中極差R值大小顯示，各因素的作用主次為B(加水量)＞C(提取時(shí)間)＞A(藥材浸泡時(shí)間)。表4方差分析結(jié)果表明:B因素各水平之間差異具有顯著性(P＜0.05)，A、C因素各水平之間差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，綜上所述最終提取工藝確定為:A2B3C3，即煎煮3次，用12倍量水，藥材浸泡30 min，每次1.5 h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)稱取生地黃藥材共3份，每份約50 g，以單因素及正交試驗(yàn)篩選的結(jié)果進(jìn)行提取，提取液濾過(guò)，濃縮至50 mL，即得樣品液，測(cè)定樣品中多糖質(zhì)量、各指紋峰相對(duì)于梓醇的量，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，多學(xué)科研究方法的不斷融合，使得對(duì)復(fù)方的研究不再停留于藥味的化學(xué)成分上，而是將化學(xué)研究和藥理研究相結(jié)合。經(jīng)藥理研究得到有效部位，對(duì)有效部位再進(jìn)行化學(xué)研究，這樣才能做到基本講清中藥復(fù)方的化學(xué)成分，基本講清中藥復(fù)方的藥效和作用機(jī)理［12］。優(yōu)選提取工藝的目的是將發(fā)揮藥效的部位得到最大程度的提取。在本實(shí)驗(yàn)中我們采用了藥理研究與化學(xué)研究相結(jié)合的方法，在數(shù)據(jù)分析中時(shí)，采用多指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析，其結(jié)果較單一指標(biāo)的評(píng)價(jià)更為科學(xué)合理。根據(jù)這一思路，我們?cè)诔浞肿鹬毓欧脚R床應(yīng)用的基礎(chǔ)上，對(duì)生地黃提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行了探索。首先，王梅等［2］和張麗娟等［3］發(fā)現(xiàn)生地黃湯的有效部位為多糖，故選擇多糖量為評(píng)價(jià)指標(biāo);其次，為了有效表征生地黃，我們選擇了樣品指紋圖譜中保留時(shí)間固定、分離度較好的數(shù)種有效成分，對(duì)這些特征成分進(jìn)行定量分析，但又因缺乏對(duì)照品，故選擇了各指紋峰相對(duì)于梓醇的含量作為另一評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而優(yōu)化篩選出生地黃的提取工藝，為該產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的參考。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

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