響應面分析法優化川芎藁本內酯提取工藝的研究

朱家校， 何 偉， 李 勇， 姚 曦

(廣東藥學院藥物研究所廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東廣州510006)

川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖，始載于《神農本草經》。其性溫，味辛、微苦，具有活血行氣、祛風止痛之功效。主治血瘀氣滯所致月經不調、痛經經閉，肝郁氣滯而致血行不暢的胸脅疼痛、頭痛、風寒濕痹、跌打腫痛等疾?。?］。川芎主要成分是藁本內酯、川芎嗪、阿魏酸等［2-4］，具有保護內皮細胞、抑制脂質過氧化、抗血栓、抗心肌缺血、舒張血管、抑制神經元變性等藥理作用［5-10］。

響應面分析法(Response Surface Methology，RSM)是一種優化工藝條件的方法，1951年Box和Wilsond首次用于確定各因素及其交互作用在工藝過程中對響應值的影響［11］。在實驗條件尋優過程中，響應面分析法可以連續地對實驗的各個水平進行分析，本實驗采用響應面分析法，以藁本內酯量為指標在單因素實驗的基礎上，考察川芎回流提取，提取溫度、含乙醇量、提取時間3個因素對提取效果的影響，優選川芎藁本內酯的最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Dionex ultimate 3000高效液相色譜儀(光電二極管陣列檢測器、Chromeleon色譜工作站);BS224S型電子分析天平(北京sartorius);HWS-12電熱恒溫水浴鍋(普瑞賽斯儀器有限公司)。

1.2 試藥 川芎藥材(批號:080401)購自廣州致信中藥飲片有限公司;藁本內酯對照品(批號:0817-9502，供定量測定用)購自天津一方科技有限公司;試劑:甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 藁本內酯測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Dikma Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相∶甲醇-水(77 ∶23);檢測波長:324 nm;柱溫:30 ℃;體積流量:1.0 mL/min，進樣量:10 μL;理論塔板數按藁本內酯計不應低于5000。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取川芎藥材粗粉10.0 g，平行2份，置圓底燒瓶中，準確加入一定量和一定濃度的乙醇，回流提取2次，每次一定時間，濾過，合并濾液，定容，搖勻，精密吸取5 mL，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密稱取藁本內酯對照品20 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，作為對照品貯備液。精密吸取對照品貯備液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，作為對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液2、3、5、10、15、20 μL 注入液相色譜儀中，測定藁本內酯色譜峰面積，以藁本內酯微克數為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)，得回歸方程為:Y=41.298 X-0.1269，r=0.9999。表明藁本內酯在 0.1600 μg ～1.600 μg 范圍內呈良好線性關系。

2.1.4 定量測定 精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀中，測定藁本內酯色譜峰面積，計算藁本內酯量。

2.2 單因素試驗確定主要影響因素及范圍

2.2.1 提取溶劑的影響 固定提取溫度為80℃，提取時間為2.0 h，料液比為1∶25，分別以水、甲醇、乙醇、丙酮為提取溶劑，加熱回流提取，以觀察不同溶劑對藁本內酯提取效果的影響(見圖1，n=3)。從圖1結果可以看出，當用甲醇或乙醇作為提取溶劑時，藁本內酯的提取量較高。由于甲醇具有一定的毒性，故選用乙醇作為提取溶劑。

2.2.2 提取溫度的影響 固定提取時間為2.0 h，料液比為1∶25，含乙醇量為70%，改變提取溫度，以觀察其對藁本內酯的提取效果的影響(見圖2-A，n=3)。從圖2-A結果可以看出，在一定溫度范圍內，隨提取溫度的升高，藁本內酯的提取量逐漸增加。當提取溫度超過80℃時，藁本內酯提取量變化不明顯。因此，將響應面試驗中的提取溫度設定在70℃ ～90℃之間。

圖1 不同提取溶劑對藁本內酯提取量的影響

2.2.3 提取時間的影響 固定提取溫度為80℃，料液比為1∶25，含乙醇量為70%，改變提取時間，以觀察其對藁本內酯的提取效果的影響(見圖2-B，n=3)。從圖2-B結果可以看出，提取時間過短，藁本內酯提取不完全;提取時間超過2 h后，藁本內酯提取量的變化不明顯。因此，將響應面試驗中的提取時間設定在1.5～2.5 h之間。

2.2.4 含乙醇量的影響 固定提取時間為2.0 h，提取溫度為80℃，料液比為1∶25，改變含乙醇量，以觀察其對藁本內酯提取效果的影響(見圖2-C，n=3)。從圖2-C結果可以看出，含乙醇量升高，藁本內酯提取量逐漸增加，70%乙醇提取量最高，但當含乙醇量繼續增大時，藁本內酯提取量明顯減少。因此，將響應面試驗中的含乙醇量設定在50% ～90%之間。

圖2 不同試驗因素對藁本內酯提取量的影響

2.2.5 料液比的影響 固定提取時間為2.0 h，提取溫度為80℃，含乙醇量為70%，改變料液比，以觀察其對藁本內酯的提取效果的影響(見圖2-D，n=3)。從圖2-D可以看出，料液比為1∶25時，藁本內酯提取量最高，料液比對藁本內酯提取效果的影響程度比其他因素要小，為了減少實驗次數，所以提取工藝中料液比固定為1∶25。

2.3 中心組合設計-響應面分析法優化提取工藝條件

2.3.1 試驗設計及結果 根據Box-Behnken中心組合設計的原理和單因素試驗結果，選取進取溫度、含乙醇量和提取時間3個對藁本內酯提取量影響較大的因素，進行3因素3水平(共15個試驗點，3個中心點)的響應面試驗，應用Design-Expert7.16軟件進行數據分析，確定川芎中藁本內酯的最佳提取條件。試驗設計與結果見表1、2。

2.3.2 模型擬合與顯著性檢驗 將所得數據采用Design-Expert7.16軟件對表2中進行數據進行二項式擬合回歸，得到以藁本內酯提取量(Y)為響應值，3個參數為自變量的二次回歸模型方程為:

表1 中心組合試驗設計因素水平編碼表

為檢驗方程的有效性，對川芎藁本內酯提取的數學模型進行方差分析，由表3可知，模型的P值小于0.01，表明二次方程擬合高度顯著，失擬項F值為12.02，顯示失擬項相對絕對誤差不顯著，而不顯著的失擬項才合理。提取溫度及提取時間對藁本內酯的提取量有顯著影響;二次項X22影響極顯著;交互項按影響大小排序依次為X1X2、X2X3、X1X3。由圖3可知，隨含乙醇量的增加，藁本內酯的提取量先升高后降低，說明藁本內酯具有一定的極性;提取時間的延長，藁本內酯的提取量先升高后降低，藁本內酯在較高溫度的條件下不穩定。剔除不顯著項后即得回歸方程式(2)。簡化的方程R=0.9608，降幅較小，說明此方程的可信度高。

表2 中心組合試驗設計與結果

表3 川芎藁本內酯提取回歸模型方差分析

2.4 最佳提取工藝驗證試驗 通過回歸模型預測的川芎藁本內酯提取的最佳工藝條件為:提取溫度88.87℃，含乙醇量70.72%，提取時間2.3 h，料液比1 ∶25，提取2 次，預測值為6.8696 mg/g。考慮到實際操作的可行性，將川芎藁本內酯提取的提取條件在回歸方程得到的理論值基礎上修正為:提取溫度 89℃，含乙醇量71%，提取時間2.3 h，料液比1∶25，提取2次，采用此工藝條件進行驗證實驗(n=3)，藁本內酯提取量分別為 6.84，6.83，6.83mg/g，均與預測值相差不大，說明本實驗所建模型得到的工藝參數準確可靠。

圖3 各因素兩兩交互作用對藁本內酯提取量影響的響應面圖

3 討論

傳統的數理統計往往采用正交設計或均勻設計［12］，尋求最佳的因素水平組合，即用線性數學模型進行擬合，試驗次數雖少，但不能在設定的整個區域上找到因素和響應值之間的一個明確的函數表達式，從而無法找到整個區域上的因素的最佳組合和響應的最優值。響應面分析法克服了正交設計和均勻設計的缺陷，通過采用非線性擬合的中心組合-效應面法研究各因素間相互作用的一種回歸分析方法。響應面分析法亦有其局限性:設計的試驗點應包括最佳的實驗條件，如果實驗點的選取不當，應用響應面分析法也不能得到很好的優化結果。因此，本實驗首先以單因素試驗確定主要影響因素及范圍，在單因素實驗的基礎上，應用響應面分析法考察藥材的提取溫度、含乙醇量、提取時間3個因素對提取效果的影響，優選藁本內酯的最佳提取工藝，有效地改善了提取效果，具有較大的實用價值。

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