水稻蛋白OsOle對(duì)葉片表皮細(xì)胞形態(tài)的影響分析

姚清國(guó)，段書(shū)德，張文娜

（石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北 石家莊 050035）

在多細(xì)胞生物中，細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互通訊是不可缺少的，細(xì)胞之間的相互識(shí)別對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和分化起著決定的作用，其中植物胞外的信號(hào)分子在細(xì)胞之間的信息傳遞中扮演者重要的角色[1]。在植物學(xué)研究中，小分子激素如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、乙烯、ABA和油菜素類(lèi)脂等一直是公認(rèn)的信號(hào)分子，人們對(duì)其比較關(guān)注而且研究比較清楚。直到10年前，一篇評(píng)述性文章“Plants，like animals，may make use of peptide signals”在 Science上發(fā)表之后，人們才開(kāi)始關(guān)注植物胞外蛋白作為細(xì)胞間信號(hào)分子的研究[2]。現(xiàn)在研究得比較清楚的胞外蛋白有 4 個(gè)，分別是系統(tǒng)素[3]、PSK[4]、CLV3[5]和SCR[6]。Olee 1是一種主要過(guò)敏原，該蛋白最早在橄欖樹(shù)的花粉中發(fā)現(xiàn)并純化，因此命名為Olee I[7]。Olee 1由145個(gè)氨基酸組成的，與已知的番茄花粉LAT52蛋白和玉米中的Zm13蛋白十分相似。Olee I的結(jié)構(gòu)域中含有6個(gè)保守的半胱氨酸，一個(gè)保守的花粉表達(dá)的序列E/Q/T/-G-X-V-Y-C-D-T/N/P-C-R。在植物中存在一個(gè)與Olee 1同源的蛋白家族，稱(chēng)為Olee 1蛋白家族，有些Ole家族的蛋白還富含脯氨酸，蛋白分子量從8 kD到50 kD，具有可溶性和穩(wěn)定性，會(huì)引起IgE調(diào)節(jié)的過(guò)敏反應(yīng)[8]。水稻基因組中有45個(gè)Olee 1家族的蛋白[9]，但它們的表達(dá)模式各不相同，推測(cè)可能參與不同的生物學(xué)過(guò)程，發(fā)揮不同的功能。筆者在水稻中找到一個(gè)與Olee 1同源并在授粉后RNA水平表達(dá)量明顯上調(diào)的基因，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻品種為日本晴[Oryza sativa（japonica cultivar-group）]；細(xì)菌菌株 DH5α、農(nóng)桿菌 EHA105均為本實(shí)驗(yàn)室保存；載體 pTCK303、pCAMBIA 1300、pYFP、pGEX-2T 為本室保存。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建 載體構(gòu)建所用的引物由生工公司或賽百盛公司合成，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出Os－Ole1連到pCAMBIA 1300上，構(gòu)建成后面融合GUS的超表達(dá)載體并進(jìn)行了測(cè)序；通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出OsOle1連到pYFP上。forward primer（Pogf）：5′-CC A AG CTT ATG GCC TCT CTC CGC ACC-3′，reverse primer（Pogr）：5′-CGG GAT CCC CTC GTT ATC ATC ATC AGC CAG GAT-3′，構(gòu)建成后面融合YFP的超表達(dá)載體。

1.2.2 水稻遺傳轉(zhuǎn)化和GUS染色 水稻遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻愈傷轉(zhuǎn)化的方法，收集轉(zhuǎn)基因水稻不同發(fā)育時(shí)期的組織，按照J(rèn)efferson的方法進(jìn)行 GUS染色[10]。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察 將上述打過(guò)基因槍的洋蔥表皮（仍在上述MS固體培養(yǎng)基的濾紙之上）放于22℃，連續(xù)光照條件下培養(yǎng)16 h，然后將洋蔥表皮置于MS緩沖液（pH 7.0）中。在Bio-Rad MR（A2）型激光掃描共聚焦顯微鏡上進(jìn)行觀察。觀察條件：以488 nm為激發(fā)光，強(qiáng)度為30%。同時(shí)打開(kāi)軟件對(duì)鏡中的目標(biāo)細(xì)胞掃圖。再用質(zhì)壁分離液（MS，0.15 mol/L的蔗糖，0.45 mol/L甘露醇）處理洋蔥表皮細(xì)胞，直至發(fā)生質(zhì)壁分離，同時(shí)進(jìn)行觀察拍照。

1.2.4 掃描電鏡觀察水稻葉片表皮細(xì)胞 掃描電鏡采用日立S-570型，分辨率3.5 nm，放大倍數(shù)20～200 000倍，取水稻的葉片，用二蒸水沖洗干凈，放入戊二醛（2.5%）中固定，采用梯度的方法進(jìn)行脫水，依次放入30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇中，每次30 min。之后放入新的100%的乙醇過(guò)夜，第二天放入醋酸異戊脂30 min，放入預(yù)冷的干燥儀樣品室，注入液態(tài)的CO2進(jìn)行置換，保持室溫20℃，壓力 50～70 Kg/cm2，20 min，溫度升到 40℃，壓力 80～100 Kg/cm2，保持 5min，放氣（速度在 100～500 mL）/min，當(dāng)壓力低于30 Kg/cm2時(shí)切斷加熱器，取出樣品，真空噴金，然后放入掃描電鏡中觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsOle1的生物信息學(xué)分析

橄欖樹(shù)花粉中發(fā)現(xiàn)的過(guò)敏原蛋白Olee 1在植物中屬于一個(gè)大的家族，在NCBI的水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中以橄欖樹(shù)Olee 1的氨基酸序列進(jìn)行搜索，得到一個(gè)同源的蛋白（CAE05158.2），序列同一性為35%（45/128），相似性為 52%（67/128），蛋白對(duì)應(yīng)的cDNA序列號(hào)為AL731591，該基因有一個(gè)內(nèi)含子，因此命名為OsOle1，OsOle1共有165個(gè)氨基酸殘基，N端1-24位氨基酸為預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列，肽鏈斷裂位點(diǎn)在24位的Ala和25位Thr之間。

將OsOle1蛋白序列在NCBI的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，得到75個(gè)相似度比較高（e＜0.01）的蛋白序列。運(yùn)用MEGA3.0對(duì)這些蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析（圖1），發(fā)現(xiàn)OsOle1和水稻，百合和玉米中的同源蛋白蛋白分布在一個(gè)大的BII分支中分支中，該分支只有12個(gè)成員，全部為單子葉植物。擬南芥，番茄和橄欖樹(shù)中與OsOle1同源的蛋白分布在另外的幾個(gè)分支中，A，BI及CI、CII分支全部都是雙子葉植物，共有64個(gè)蛋白。由此可見(jiàn)，Ole家族的蛋白在單子葉和雙子葉植物進(jìn)化中有明顯的區(qū)別。

圖1 Ole家族的進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

該進(jìn)化樹(shù)中有功能注釋的5個(gè)蛋白分別是：橄欖樹(shù)中的Olee 1（P19963），擬南芥中的SAH7（NP567338），玉米中的Zm13（P33050），百合中LLP-B3（ANN76546），番茄中的 LAT52（P13347）。選取這五個(gè)蛋白與水稻中的OsOle1進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蛋白與花粉特異的Ole_e_I家族保守序列 [EQT]-G-x-V-Y-C-D-[TNP]-C R在相同的位置上都具有6個(gè)保守的半胱氨酸（圖2）。進(jìn)一步分析OsOle1的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)該蛋白有推測(cè)的豆蔻酰化位點(diǎn)G-{EDRKHPFYW}-X（2）-[STAGCN]-{P}，位于 N 端第 128 位，因此該蛋白容易被豆蔻?；揎楀^定于質(zhì)膜上。OsOle1在N端第33位具有花粉中特異表達(dá)的保守序列[EQT]-G-x-V-Y-C-D-[TNP]-C R。

圖2 部分Ole e 1家族蛋白的保守序列比對(duì)分析

2.2 轉(zhuǎn)基因水稻的表型觀察

2.2.1 掃描電鏡觀察OsOle1超表達(dá)株系葉片在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，對(duì)OVY3的T0代的小苗葉片進(jìn)行觀察，和野生型葉片比較起來(lái)，OVY3株系葉片暗綠，推測(cè)葉片的表皮細(xì)胞可能發(fā)生改變，進(jìn)一步對(duì)三葉期的OVY3的葉片作了掃描電鏡的觀察，結(jié)果如圖3所示。對(duì)野生型和OVY3葉片的近軸面觀察發(fā)現(xiàn)，野生型的葉片表皮細(xì)胞的細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞的邊界比較平滑，形狀規(guī)則。與野生型的相比，OVY3葉片近軸面表皮長(zhǎng)細(xì)胞長(zhǎng)度變短（圖3中箭頭所示），且形狀發(fā)生改變，表皮細(xì)胞周?chē)吔缱兊牟灰?guī)則。表皮的短細(xì)胞變化不大。推測(cè)可能是由于OsOle1的超表達(dá)影響葉片進(jìn)軸面的長(zhǎng)細(xì)胞發(fā)育。

對(duì)野生型和OVY3葉片遠(yuǎn)軸面觀察發(fā)現(xiàn)，野生型遠(yuǎn)軸面表皮細(xì)胞的角質(zhì)層突起比較平滑，細(xì)胞形狀比較細(xì)長(zhǎng)。與野生型相比，OVY3葉片表皮細(xì)胞的形狀變的不規(guī)則，角質(zhì)層突起比較粗燥（箭頭表示），每個(gè)角質(zhì)層突起邊緣有許多小的突起（圖4下排），這種角質(zhì)突起主要有蠟質(zhì)來(lái)組成?？赡苁荗s－Ole1的超表達(dá)影響了葉片遠(yuǎn)軸面臘質(zhì)層的形成。

3 討 論

3.1 OsOle1與Olee 1在進(jìn)化上的關(guān)系

在水稻基因組中有45個(gè)編碼Olee 1家族蛋白的基因，其中只有一小部分在花粉中特異的表達(dá)，而大部分在其它營(yíng)養(yǎng)組織也有表達(dá)，推測(cè)水稻中這些基因可能發(fā)揮與Olee 1不同的生物學(xué)功能。

OsOle1主要在花器官中表達(dá)，在進(jìn)化上與玉米的Zm13和百合的LLP-B3蛋白等單子葉植物聚在BII分支中，而與雙子葉的Olee 1家族的蛋白相距較遠(yuǎn)。在雙子葉家族A亞家族中有一個(gè)番茄花粉中表達(dá)的LAT52蛋白，反義表達(dá)的LAT52影響花粉的水合和萌發(fā)。由于物種的不同，OsOle1、LAT52和Olee I在不同的進(jìn)化分支中，三者之間有一定的距離，表明在雙子葉和單子葉在進(jìn)化上出現(xiàn)分支后，該家族的蛋白為適應(yīng)不同類(lèi)型花粉的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式而進(jìn)化成不同的形式，在不同物種中可能發(fā)揮著不同的功能。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白大都有保守的6個(gè)半胱氨酸的，兩半胱氨酸之間可以形成二硫鍵，二硫鍵的形成有助于蛋白維持一定的空間構(gòu)象，對(duì)其功能的發(fā)揮起重要作用。

3.2 OsOle1與葉表皮細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系

在OsOle1的過(guò)表達(dá)植株中觀察到野生型的顏色為淺綠色，而超表達(dá)的葉片暗綠色，近軸面和遠(yuǎn)軸面表皮細(xì)胞形狀也變得不規(guī)則，而且遠(yuǎn)軸面表皮細(xì)胞的乳狀突起的蠟質(zhì)突起變得不規(guī)則，可能是OsOle1影響了表皮細(xì)胞的分化。蠟質(zhì)層是在細(xì)胞內(nèi)合成再分泌的胞外裝配而成的，OsOle1很可能影響了蠟質(zhì)層在胞外的裝配過(guò)程。除此之外OsOle1的超表達(dá)還影響到花粉的萌發(fā)和植株的高度，后續(xù)的研究正在進(jìn)行中。

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