大蒜素對植煙土壤酶活性的影響

蘇循發(fā)，龔道新,2，項(xiàng)裕昆，謝 慧

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)研究所，湖南 長沙 410128）

土壤酶是土壤的重要組成部分，土壤中大量的生化過程都是在它們的參與下完成的。在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量循環(huán)等過程中，土壤酶起到表征物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化強(qiáng)度的作用。因此，土壤酶可作為土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警和敏感指標(biāo)[1]。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥的大量使用勢必對土壤質(zhì)量造成一定影響，因此，農(nóng)藥的生態(tài)風(fēng)險評價必不可少，土壤酶活性是農(nóng)藥風(fēng)險評價的重要內(nèi)容之一[2]。大蒜素作為新型殺菌劑生物農(nóng)藥，對煙草上青枯菌和黑脛病菌有良好的抑制作用，大蒜素在煙田中的施用同樣會對植煙土壤酶活性有影響。有關(guān)化學(xué)農(nóng)藥對土壤酶活性的影響已有許多報道[3-5]，但關(guān)于大蒜素對植煙土壤中蔗糖酶、脲酶和過氧化氫酶活性影響的研究在國內(nèi)外卻未見報道。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器設(shè)備：電子天平、恒溫水浴鍋、人工氣候箱、WFJ型721分光光度儀、酸式滴定管、WHY-2型水浴恒溫振蕩器、微量噴霧器等。

藥品和試劑：88.4%大蒜素標(biāo)準(zhǔn)樣品；30%H2O2、98%濃 H2SO4、0.1 mol/L KMnO4溶液（用草酸鈉標(biāo)定）、3,5-二硝基水楊酸、pH值6.7的檸檬酸－磷酸緩沖溶液、pH值5.5的磷酸緩沖溶液、NaOH、酒石酸鉀鈉、蔗糖、葡萄糖、結(jié)晶酚、尿素、苯酚鈉溶液、次氯酸鈉、硫酸胺等。以上試劑均為分析純。

氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.471 7 g硫酸銨溶于水并定容至1 000 mL，制得含0.1 mg/mL氮的標(biāo)準(zhǔn)液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.550 5 g葡萄糖溶于水，定容至1 000 mL，制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2 試驗(yàn)材料

土壤樣品取自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園試驗(yàn)基地的煙田，土壤為河潮土。土壤樣品經(jīng)自然風(fēng)干，去除砂石、植物根系等非土壤部分，研碎過20目篩后備用。供試土壤的理化性質(zhì)如下：土壤有機(jī)質(zhì)含量2.31%，pH值6.2，土壤粘粒、粉粒和沙粒含量分別為24.5%、48.3%和27.2%。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取已制備好的土壤樣品200.0 g若干份，計算出使土壤中大蒜素的含量分別為0（CK）、1.0、10.0和50.0 mg/kg，將所配制的大蒜素溶液用微量噴霧器均勻地噴灑于土樣中（重復(fù)3次），邊噴邊用玻璃棒攪動，噴完后，將土壤反復(fù)過10目篩，直至均勻。然后，根據(jù)土壤重量加入蒸餾水至土/水=1/1.2，置于（25±1）℃人工氣候箱中培養(yǎng)，每天光照14 h，黑暗時間為10 h，培養(yǎng)過程中及時補(bǔ)充水分，切忌干涸。重復(fù) 3 次。在培養(yǎng) 1、3、5、7、10、20、30 d 后取土壤樣品檢測其中蔗糖酶、脲酶和過氧化氫酶的活性。

1.4 植煙土壤中酶活性的測定方法

1.4.1 蔗糖酶活性的測定[6]其測定原理為：蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，而葡萄糖能與3,5-二硝基水楊酸生成橙色物質(zhì)，可在分光光度計上508 nm處比色測定。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制：吸取配置好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 移至 50 mL 容量瓶，分別加蒸餾水 2、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL，再加 3 mL 3,5-二硝基水楊酸，沸水浴中加熱5 min，冷卻后定容。將顯色液在分光光度計上于508 nm處比色測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.001 C-0.004 3，相關(guān)系數(shù)R為0.999 6。

測定方法：稱取5 g上述培養(yǎng)的土壤樣品，置于50 mL三角瓶中，加入15 mL 8%蔗糖溶液，5 mL pH值5.5的磷酸緩沖液和5滴甲苯搖勻混合后，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h后取出，迅速過濾，從中吸取濾液l mL，注入50 mL容量瓶中，加3 mL 3,5-二硝基水楊酸，沸水浴中加熱5 min，冷卻并定容，在分光光度計上于508 nm波長處進(jìn)行比色測定。根據(jù)吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線算出葡萄糖含量。蔗糖酶活性以24 h后每克干土所能催化生成的葡萄糖的毫克數(shù)表示。蔗糖酶活性1 U=1 mg葡萄糖/g干土·24h。

1.4.2 脲酶活性的測定[6]其測定原理為：脲酶能酶促尿素生成氨、二氧化碳和水。氨能與“苯酚—次氯酸鈉”在堿性條件下生成藍(lán)色的靛酚，后者可在分光光度計上630 nm處比色測定。

氮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制：準(zhǔn)確吸取5.00 mg/mL的氮溶液10.00 mL，定容至100 mL，即稀釋了10倍，吸取 0、2、4、6、8、10 mL 移至 50 mL 容量瓶，加水至20 mL，再加入4 mL 1.35 mol/mL苯酚鈉，仔細(xì)混合，加入3mL 0.9%次氯酸鈉，充分搖蕩，放置l h，顯色后用蒸餾水稀釋至刻度。將顯色液在分光光度計上于630 nm處進(jìn)行比色測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.044 7 C+0.009，相關(guān)系數(shù)R為0.995 9。

測定方法：稱取相當(dāng)于5 g干土，置于50 mL的三角瓶中，加入l mL甲苯。15 min后加入10 mL 10%的尿素溶液和20 mL pH值6.7的檸檬酸鹽緩沖液，搖勻后在37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，過濾，從中取3 mL濾液注入50 mL容量瓶中，然后加蒸餾水及4 mL苯酚鈉溶液和3 mL 0.9%次氯酸鈉溶液，放置l h后用蒸餾水定容至刻度，進(jìn)行比色，測定其吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出NH3-N含量。脲酶活性以24 h后每克土壤中NH3-N的毫克數(shù)表示。脲酶1 U=1 mg NH3-N/g干土·24h。

1.4.3 過氧化氫酶活性的測定[7]其測定原理為：過氧化氫酶能酶促過氧化氫分解為水和分子氧。向土壤中加入過量的過氧化氫，在過氧化氫與土壤相互作用后，未分解的過氧化氫可用高錳酸鉀滴定，這樣就可以求出酶促反應(yīng)所用過氧化氫的量，從而測定出土壤中過氧化氫酶的活性。

測定方法：取2 g上述培養(yǎng)土壤，置于100 mL三角瓶中，并注入40 mL蒸餾水和5.0 mL 0.3%過氧化氫溶液。將三角瓶放在恒溫水浴振蕩器上振蕩20 min。而后加入5 mL 3 mol/L硫酸，以穩(wěn)定未分解的過氧化氫。再將瓶中懸液用慢速型濾紙過濾。然后吸取25 mL濾液，用0.l mol/L高錳酸鉀滴定至淡粉紅色終點(diǎn)，消耗的高錳酸鉀量記為B。另取5.0 mL 0.3%過氧化氫與40 mL蒸餾水以及5 mL 3 mol/L硫酸混合，用0.l mol/L高錳酸鉀測定，消耗的高錳酸鉀量記為A。A-B所得的差乘以高錳酸鉀滴定度的校正值T，即為土壤過氧化氫酶的活性：（AB）×T。以每克土壤消耗的0.1 mol/L高錳酸鉀的毫升數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜素對植煙土壤中蔗糖酶活性的影響

從圖1可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，大蒜素對植煙土壤中蔗糖酶活性的影響表現(xiàn)為“抑制（處理后前7 d）→激活（處理后第10天至第30天）”的過程。處理后前7 d，大蒜素對植煙土壤中蔗糖酶都表現(xiàn)出抑制作用，且大蒜素濃度越大，抑制作用越明顯，7 d時50.0 mg/kg的大蒜素對蔗糖酶的抑制率達(dá)到了89.32%。從處理后的第10天開始，各濃度的處理都開始表現(xiàn)出激活作用，激活作用的大小與大蒜素濃度的高低呈正相關(guān)，直到第30天，這種激活作用也未消失。這可能是由于高濃度大蒜素施用初期對土壤中可產(chǎn)生蔗糖酶的微生物有一定的抑制作用，但這類微生物很快適應(yīng)，并能利用大蒜素作為碳源和能源，使蔗糖酶活性很快恢復(fù)或增強(qiáng)。

圖1 大蒜素對植煙土壤中蔗糖酶活性的影響

2.2 大蒜素對植煙土壤中脲酶活性的影響

由圖2可知，大蒜素對植煙土壤中脲酶活性的影響表現(xiàn)出先激活再抑制再激活的作用。但低濃度的大蒜素對脲酶活性的激活與抑制作用均弱于高濃度的大蒜素。在處理后的前3 d各濃度的大蒜素對脲酶均表現(xiàn)出激活作用，3～10 d表現(xiàn)為抑制作用，隨后又轉(zhuǎn)為激活作用，20 d時50.0 mg/kg的大蒜素對脲酶的激活作用達(dá)到了31.35%。30 d后激活作用基本上消失，可以回復(fù)到正常水平。

圖2 大蒜素對植煙土壤中脲酶活性的影響

2.3 大蒜素對植煙土壤中過氧化氫酶活性的影響

由圖3可知，處理初期各濃度的大蒜素均能夠激活過氧化氫酶，并且隨著濃度的升高其活性增強(qiáng)。從處理后第5天至處理結(jié)束，各濃度的大蒜素對過氧化氫均表現(xiàn)為抑制作用，且各濃度的大蒜素的抑制率基本相等，隨著時間的推移抑制作用逐漸減弱，直至恢復(fù)到對照水平。這可能是因?yàn)槌跗诖笏馑乜梢源碳の⑸锎x產(chǎn)生更多的過氧化氫酶，而隨著處理時間的延長，土壤中通氣狀況有所惡化，加之可提供土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有毒有害代謝產(chǎn)物的積累等，使土壤中過氧化氫酶的活性下降[8]。

圖3 大蒜素對植煙中土壤中過氧化氫酶活性的影響

3 結(jié)論

（1）大蒜素對土壤中蔗糖酶的影響較大，且濃度越高影響越大。總體表現(xiàn)為前期抑制，后期激活的過程。

（2）大蒜素對土壤脲酶的影響總體表現(xiàn)為激活作用，但在3～10 d有抑制作用，總體與大蒜素的濃度無明顯關(guān)系。

（3）大蒜素對過氧化氫酶的影響表現(xiàn)為“激活－抑制”過程，且各濃度的大蒜素對過氧化氫酶的影響基本相同。

[1]張詠梅，周國逸，吳 寧，等.土壤酶學(xué)的研究進(jìn)展[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2004，12（1）：83-90.

[2]馮 波，單 敏，方 華，等.百菌清對土壤微生物數(shù)量和酶活性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2006，25（3）：674-677.

[3]肖志高，龔道新，施 翔，等.咪鮮胺及其制劑和主要代謝物對土壤過氧化氫酶活性的影響 [J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2006，25（3）：728-732.

[4]李時銀，黃 智，倪利曉，等.毒死蜱及代謝產(chǎn)物對土壤過氧化氫酶活性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，2002，21（6）：553-555.

[5]郭 明，尹亞梅，何良榮，等.農(nóng)用化學(xué)物質(zhì)對土壤脲酶活性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，2000，19（2）：68-71.

[6]龔道新.咪鮮胺及其主要代謝物在水稻田中的行為與效應(yīng)研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2005.65-83.

[7]關(guān)松蔭.土壤酶及其研究法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1986.163-170.

[8]劉惠君，劉維屏，楊煒春，等.均三氮苯類除草劑對土壤酶活性的影響[J].土壤學(xué)報，2003，40（2）：286-292.