臘梅葉揮發性成分及其抑菌活性研究

劉祝祥，賀建武，彭德嬌，向 芬，石進校

（吉首大學植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，生物資源與環境科學學院，湖南 吉首 416000）

臘梅（Chimonanthus praecox）隸屬臘梅科（Calycanthaceae），為第四紀冰川孑遺植物[1]，是我國特有的傳統名花和經濟樹種，秦嶺以南和橫斷山脈以東為其現代分布中心[2]。臘梅花、葉、莖、根均能入藥，具有解暑生津，鎮咳止痰的功效[3]。刁軍成等[4]對臘梅的同屬植物山臘梅葉進行了抑菌研究，發現其溫熱蒸發物對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用，并且水提取液能直接抑制流感病毒。朱華年等[5]研究發現臘梅葉的甲醇提取物具有一定的清除自由基活性。目前，對臘梅葉揮發性成分及其抑菌活性等方面的研究未見文獻報道，為綜合開發利用臘梅資源，本文采用超臨界CO2流體萃取技術萃取臘梅葉揮發性成分，結合GC-MS聯用技術對揮發性成分進行分離和鑒定，并對其抑菌活性進行了研究，以期為臘梅的利用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品 野生臘梅葉采于吉首德夯，臘梅由吉首大學生物資源與環境科學學院陳功錫教授鑒定為臘梅科臘梅屬臘梅。采集好的臘梅葉經45℃低溫烘干，碾碎備用。

1.1.2 儀器與試劑 華安HA121-50-1型超臨界流體萃取裝置（江蘇南通華安超臨界流體萃取有限公司）；氣質聯用器：GCMS-QP2010（日本島津，配NIST2005標準質譜庫）。所用試劑均為國產分析純。

1.1.3 抑菌指示菌與培養基 用于抑菌實驗的8個敏感指示菌為：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）、黑曲霉（Asperillus niger）、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、變形桿菌（Proteus vulgaris）、白色念珠球菌（Candida albicans），由吉首大學微生物資源與生態實驗室保藏。培養基為營養瓊脂培養基。

1.2 方法

1.2.1 揮發性成分超臨界CO2流體萃取 稱取臘梅葉干粉500 g裝入料筒，放進萃取釜，按工藝要求開啟萃取裝置，調節萃取溫度為35℃、萃取壓力25 Mpa、CO2流量 15 L/min，待制冷系統、萃取溫度和CO2流量穩定后，開動高壓泵進行循環萃取。從鋼瓶出來的CO2經過濾系統和制冷系統后，經高壓泵達所需壓力，由預熱系統升至所需溫度后，與原料接觸，被萃取成分溶解在CO2中，萃取物流入分離系統，萃取時間為3 h，改變壓力，降低萃取物在超臨界CO2中的溶解度而析出，萃取物用收集瓶接收，CO2氣體經系統循環利用。

1.2.2 揮發性成分GC-MS分析 色譜柱為RTX-5MS彈性毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：柱起始溫度60℃，保持1 min，以10℃/min的速率升至160℃，保持4 min，再以5℃/min的速率升至260℃，保持5 min；進樣口溫度250℃；載氣（氦氣）流量為 1 mL/min；進樣量 0.5 μL，分流比為 1:30。質譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度：200℃，接口溫度230℃，掃描范圍29～450 amu。

1.2.3 抗菌活性的測定[6]采用濾紙片瓊脂擴散法測定臘梅葉揮發性成分的抗菌活性，取八種指示菌分別接種于培養基中，混合倒平板，待培養基凝固，在超凈工作臺上分別取兩片蘸有臘梅葉揮發性成分的小紙片貼在含有指示菌的培養基表面。置于恒溫培養箱中，28℃培養48 h后觀察抑菌圈大小。重復3次。

2 結果與分析

2.1 超臨界CO2流體萃取結果

按照上述萃取條件，經過3 h萃取，共得到約3 mL油狀物。

2.2 GC-MS分析結果

用GC-MS技術對臘梅葉揮發性成分進行分離和鑒定，總離子流圖見圖1。對總離子流圖中的各峰經積分，按峰面積歸一化法確定各組分相對含量，并結合NIST2005標準質譜庫，對各峰進行鑒定，結果見表1。

圖1 臘梅葉揮發性成分GC-MS總離子流圖

由表1可知，通過GC-MS技術分離和鑒定，臘梅葉揮發性成分中共鑒定出25種化學成分，占揮發性成分相對含量的98.47%，主要為稠環芳烴、烷烴、醇、烯、酚、酯和少量脂肪酸。其中醇相對含量占37.75%、烷烴相對含量占28.58%、烯烴相對含量占11.15%、稠環芳烴萘占10.23%、酯相對含量占4.31%，酚相對含量占2.84%，還含有少量的脂肪酸。

2.3 活性測定結果

以濾紙片瓊脂擴散法測定臘梅葉超臨界CO2萃取物的揮發性成分的抗菌活性，結果表明揮發性成分對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌均有抑菌現象（表2），其中對金黃色葡萄球菌的抗菌效果最佳。

3 小結與討論

利用超臨界CO2流體萃取技術，部分脂溶性化合物在CO2籠罩下進行提取，可以有效地防止熱敏及光敏性物質的氧化和逸散[7]，比常規的水蒸氣蒸餾法能更好地萃取臘梅葉的揮發性化學成分。通過GC-MS聯用技術分離鑒定出臘梅葉揮發性化學成分，主要有稠環芳烴、烷烴、醇、烯、酚、酯和少量脂肪酸物質。臘梅葉揮發性化學成分中環扁桃酯是一種能改善血流變及血栓形成的有效化合物[8]；2,4-二叔丁基苯酚是制備抗氧化劑的重要中間體[9]；葉綠醇能有效降低血清總膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇的含量[10]；β-波旁烯我們曾在研究臘梅籽化學成分中也有報道；β-欖香烯體內外均有顯著的抗腫瘤作用，可有效誘導腫瘤細胞凋亡；鄰苯二甲酸酯有抗氧化、抗癌、抗菌及驅蟲避蚊等活性。抑菌結果表明，臘梅葉揮發性成分抗菌譜廣，對金黃色葡萄球菌的抗菌效果明顯，從中鑒定出來的重要化合物，具有抗菌、抗癌等生物活性。臘梅葉作為傳統消炎殺菌藥物，可能與這些抑菌成分有關。上述結果表明，臘梅葉具有較重要的價值，值得進一步研究以促進其在醫藥和農業上的利用。

表1 臘梅葉揮發性成分GC-MS分析結果

表2 臘梅葉揮發性成分抑菌試驗結果

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[4]刁軍成，伍學洲，丁 舸.山臘梅葉消毒抑菌的實驗研究[J].江西中醫藥，2002，33（6）：35.

[5]朱華年，朱永勝，胡豐林.臘梅葉提取物的清除自由基活性及薄層色譜和液質聯用分析 [J].安徽農學通報，2007，13（16）：30-31.

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