DNA聚合酶η蛋白表達差異與OVCR3細胞順鉑敏感性以及TP方案化療的卵巢上皮癌患者臨床療效相關(guān)性分析

曹麗芝，曾 勇，任華益，陳金燕

湖南省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，湖南長沙 410013

卵巢原發(fā)性惡性腫瘤中有60%～80%病理類型屬于上皮性卵巢癌。卵巢癌作為最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，由于其臨床發(fā)病隱匿，且缺乏特異性的早期發(fā)病指征，晚期卵巢癌患者生存率極低，僅達到25%左右[1-3]。目前，上皮性卵巢癌患者的預(yù)后以及生活質(zhì)量均無法得到很好的提升。20世紀90年代以來，多項大規(guī)模的臨床研究提示，采用紫杉醇聯(lián)合順鉑作為晚期卵巢癌的標準化療方案對于該類患者的治療具有及其重要的地位。但是，在上述聯(lián)合化療過程中，因為患者表現(xiàn)的對鉑類藥物耐藥的現(xiàn)象導(dǎo)致療效不佳是眾多臨床學(xué)者無法回避的客觀事實。鉑類藥物作為一類卵巢癌的化療過程中最有效的細胞毒藥物，通過形成鉑-DNA絡(luò)合物，導(dǎo)致DNA致命性損傷，誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮作用[4-5]。鉑類藥物雖然耐藥機制十分復(fù)雜，最新的研究已經(jīng)明確DNA損傷修復(fù)是其最主要的機制之一。在DNA的損傷修復(fù)過程中，DNA聚合酶發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其中聚合酶η起最關(guān)鍵的作用。DNA聚合酶通常分為經(jīng)典聚合酶以及跨損傷復(fù)制聚合酶兩種，跨損傷復(fù)制聚合酶尤其是聚合酶η蛋白能夠在細胞DNA受到損傷的情況下保證細胞的復(fù)制得以順利進行，在保護細胞的同時也造成了耐藥現(xiàn)象的發(fā)生[6-8]。根據(jù)以上背景，筆者認為從聚合酶η蛋白的表達情況出發(fā)，分別從基因、蛋白水平研究該聚合酶與順鉑藥物敏感性的關(guān)系，結(jié)合順鉑臨床療效的觀察，對于分析順鉑耐藥的機制有著積極的意義。本文在基礎(chǔ)研究水平，通過MTT法比較siRNA沉默目的基因前后OVCR3細胞對于鉑類藥物的敏感性，首先驗證DNA聚合酶η蛋白與細胞順鉑敏感性的關(guān)系。同時，通過分析病理組織標本中聚合酶η蛋白表達情況，觀察其與臨床資料的相關(guān)性。旨在從基礎(chǔ)以及臨床兩個水平分析聚合酶η蛋白在卵巢上皮癌順鉑耐藥過程中發(fā)揮的作用，為下一步攻克鉑類藥物耐藥現(xiàn)象提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 OVCR3細胞購自上海中科院細胞生化所。

1.1.2 病理組織來源 選取我院入院治療的卵巢上皮癌50例患者手術(shù)切除病理組織標本。患者年齡23～63歲，平均43.7歲。所有組織標本經(jīng)病理證實為上皮性卵巢癌。上皮性卵巢癌按FIGO標準分期和組織學(xué)分級（GRADE）。

1.1.3 主要試劑 RNA干擾試劑盒 （Silencer TM siRNA Construction Kit）購自美國Ambion公司；陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine TM 2000購自Invitrogen公司；噻唑藍（MTT）（Sigma公司）；RT-PCR 試劑盒購自 Sigma公司；目的蛋白鼠單克隆抗體為美國ADI抗體公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計及合成 根據(jù)DNA聚合酶η蛋白編碼基因序列以及siRNA設(shè)計原則，由啟始密碼子開始，選擇長度為20個bp的候選序列為siRNA靶序列。通過Blast軟件進行同源性分析，排除存在同源序列的靶序列，并最終確定3段長度為21bp的基因序列為靶序列。靶序列的確定與引物合成由Sigma公司完成。

1.2.2 MTT法進行耐藥性分析 取對數(shù)生長期OVCR3細胞株接種于96孔板，每孔1×106/ml單細胞懸液，每孔接種90 μl，每組設(shè) 3 個復(fù)孔，加入不同濃度的順鉑（10 μmol/L，30 μmol/L，60 μmol/L），空白對照為細胞培養(yǎng)液，陰性對照為未處理的細胞懸液。培養(yǎng)48 h后加入5 mg/ml MTT溶液，每孔200 μl，孵育12 h后 加入DMSO 100 μl，搖勻10 min，酶標儀測定光密度D570 nm值。通過直線回歸法計算藥物的IC50。

1.2.3 RT-PCR檢測聚合酶η編碼基因表達 在6孔板中接種2×105/孔濃度的單細胞懸液，待細胞培養(yǎng)至85%的覆蓋率時，使用Trizol提取總RNA，RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用引物擴增目的基因。配置2.0%瓊脂糖凝膠，在120 V、25 min條件下對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，并用凝膠成像系統(tǒng)進行圖片的采集。

1.2.4 免疫染色及結(jié)果判定 4%甲醛固定標本，石蠟包埋后切片。使用1∶50濃度單抗工作液，采用S-P法染色，陽性著色部位在細胞核。應(yīng)用枸櫞酸鹽緩沖液（PH 6.0）以及加熱法進行抗原修復(fù)。陽性定位于細胞核，鏡下見著棕黃色的細胞為陽性，從陽性表達強度和陽性表達率兩方面進行雙盲法觀察與記分。染色強度分 4級：無表達為0分，可疑表達為1分，弱陽性表達為 2分，陽性表達為3分，強陽性表達為4分。表達陽性率按百分比分別記分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。最后得分為每個研究病例的染色強度和陽性百分數(shù)相加數(shù)，最后分為3個級別：0～1 分為陰性（－），2～3 分為陽性（＋），4～5 分為強陽性（＋＋）。

1.3 臨床資料收集

收集患者住院號、姓名、年齡、住院時間、手術(shù)日期、術(shù)后評價、手術(shù)病理分期、腫瘤病理類型、腫瘤組織分化程度、術(shù)后至初次化療開始時間、化療方案、初次化療至復(fù)發(fā)的時間、化療療程、CA125水平變化等指標。

1.4 療效判定標準

完全緩解（CR）：所有目標病灶消失；部分緩解（PR）：病灶長徑總和縮小≥30%；病情穩(wěn)定（SD）：病灶長徑總和有縮小但未達到30%或者增加＜20%；疾病進展（PD）：病灶長徑總和增加＞20%。 有效率（RR）=完全緩解（CR）+部分緩解（PR）。

1.5 隨訪

入組通過電話方式進行隨訪，了解患者的生存期以及是否同期進行相關(guān)治療。患者從初次化療開始直至死亡或者是研究結(jié)束的時間間隔定義為生存期。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA對OVCR3細胞DNA聚合酶η蛋白編碼基因表達的影響

采用Alpha Innotech軟件采集比較siRNA轉(zhuǎn)染前后，OVCR3細胞DNA聚合酶η蛋白編碼基因表達差異，結(jié)果顯示以30 nmol/L濃度轉(zhuǎn)染細胞24 h后，目的基因表達水平顯著降低（P<0.05），在 24 h 后下調(diào)（85.37±0.59）%。 見圖 1。

2.2 MTT法檢測siRNA轉(zhuǎn)染后，OVCR3細胞對順鉑敏感性的改變

分別對對照組細胞以及siRNA處理后的細胞，通過酶標儀在570 nm波長測定吸光度值（OD值）。具體的藥物抑制率計算公式為：藥物抑制率＝（1-OD實驗組-OD空白對照/OD陰性對照-OD空白對照）×100%。結(jié)果顯示，不同濃度順鉑（10μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L） 對 對 照 組 細 胞 的 抑 制 率 分 別 為（35.27±0.98）%、（62.31±0.75）%、（79.26±0.88）%； 不同濃度順鉑（10 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L）對 siRNA 處理后細胞的抑制率分別為（57.15±0.64）%、（73.57±0.53）%、（88.19±0.55）%。通過擬合回歸直線，順鉑對兩組細胞的IC50分別為（46.66±2.23）μmol/L、（30.21±3.09）μmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 DNA聚合酶η蛋白在卵巢癌組織中的表達

50例組織標本中，DNA聚合酶η蛋白表達為強陽性標本13例，占26.0%；陽性標本25例，占50.0%；陰性標本12例，占24%。見圖2-4。

2.4 DNA聚合酶η蛋白表達差異與TP方案治療患者近期療效的關(guān)系

50例共完成TP化療322個療程，平均每個患者6.44個療程。總有效率為64.0%。其中，聚合酶表達強陽性組有效率為46.2%，陽性組有效率為64.0%，陰性組有效率為83.3%，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 不同DNA聚合酶表達含量組間TP方案治療近期療效比較（例）Tab.1 Short term effect of TP therapy strategy among the groups with different DNA polymerase expression(caes)

2.5 DNA聚合酶η蛋白表達差異與TP方案治療患者遠期療效的關(guān)系

截至2010年3月31日，隨訪50例患者中位生存時間為（23.5±5.1）個月，其中DNA聚合η蛋白表達強陽性組中位生存時間為（15.7±3.6）個月，陽性組為（18.5±2.7）個月，陰性組為（28.3±1.9）個月，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

卵巢癌的臨床診療過程具有早發(fā)現(xiàn)困難、術(shù)后易復(fù)發(fā)、對化療中度或低度敏感的特點，目前的臨床治療主要包括腫瘤細胞減滅術(shù)以及化療藥物聯(lián)合治療兩種手段。該類患者近20年的治療后5年生存率在40%左右。

鉑類藥物屬于影響細胞DNA合成的周期非特異性抗腫瘤藥物，具有廣譜、對實體瘤尤其是對一般化療不敏感的腫瘤效果顯著的特點。目前，對初次治療的上皮性卵巢癌的有效率可以達到50%左右，是目前一線化療方案中的重要治療藥物。

鉑類藥物的耐藥現(xiàn)象一直是臨床工作者與科研工作保持高度重視的問題之一。也是導(dǎo)致腫瘤患者無法完成系統(tǒng)化療的重要原因之一。從藥物的作用機制反推耐藥發(fā)生的機制，并尋求解決的方案是目前探討鉑類耐藥的重要研究方向。從作用機制來看，鉑類藥物是通過破壞細胞中的DNA雙鏈發(fā)揮細胞毒作用。目前的研究已經(jīng)明確，細胞自身存在修復(fù)機制對抗藥物的破壞進程。如果修復(fù)的機制強于藥物的破壞進程，細胞將顯現(xiàn)出對藥物的敏感性降低，甚至是引發(fā)耐藥現(xiàn)象的發(fā)生[9]。DNA聚合η蛋白是細胞修復(fù)過程中重要的蛋白，尤其是對于存在結(jié)構(gòu)破壞的DNA的修復(fù)[10]。

基于以上背景，筆者開展了本次研究。從細胞水平以及臨床觀察兩個方面對于DNA聚合η蛋白在順鉑耐藥現(xiàn)象中發(fā)揮的作用進行探討。在體外研究水平，筆者將目的基因表達使用沉默的方法加以抑制，觀察目的基因表達與細胞對順鉑的敏感性的影響。結(jié)果顯示，未進行目的基因沉默的OVCR3細胞以及基因沉默的OVCR3細胞對順鉑的敏感性差異明顯，順鉑對上述兩種細胞的IC50分別為（46.66±2.23）μmol/L、（30.21±3.09） μmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。該結(jié)果的得出可以明確DNA聚合η蛋白編碼基因的表達能夠明顯影響細胞對于順鉑藥物的敏感性，且其表達的下調(diào)能夠增加細胞的藥物敏感性。從機制上分析，目的基因的沉默將直接導(dǎo)致后續(xù)相應(yīng)功能蛋白的表達下調(diào)，導(dǎo)致能夠發(fā)揮修復(fù)作用的DNA聚合η蛋白的表達下降，并直接導(dǎo)致細胞對于藥物敏感性的增加。在體外研究的基礎(chǔ)上，筆者使用免疫組化的方法觀察不同患者病理組織的DNA聚合η蛋白的表達。結(jié)果提示，不同患者間目的蛋白的表達存在明顯差異，且蛋白表達的差異與藥物的近期療效呈現(xiàn)相關(guān)性。其中，聚合酶表達強陽性組有效率為46.2%，陽性組有效率為60.0%，陰性組有效率為83.3%，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)合遠期療效觀察，隨訪50例患者中位生存時間為（23.5±5.1）個月，其中DNA聚合η表達強陽性組中位生存時間為（15.7±3.6）個月，陽性組為（18.5±2.7）個月，陰性組為（28.3±1.9）個月，三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。臨床觀察的結(jié)果顯示DNA聚合η蛋白表達相對較低患者，藥物治療的有效率以及患者的生存期均較高。從臨床水平能夠一定程度的驗證DNA聚合η蛋白的表達下降，細胞對順鉑敏感性增高的體外實驗結(jié)果。

本次觀察，分別使用基因沉默技術(shù)以及免疫組化的方法，分別從體外細胞水平以及體內(nèi)臨床觀察兩個層面驗證了DNA聚合η蛋白對于腫瘤細胞對順鉑的敏感性以及化療藥物療效之間的關(guān)系，提示DNA聚合η蛋白的表達下調(diào)，能夠增加腫瘤細胞對藥物的敏感性。上述結(jié)論為制藥企業(yè)開發(fā)新的化療藥物位點以及臨床醫(yī)生制訂治療模式提供了前期的基礎(chǔ)性研究。

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