大蒜素聯合索拉菲尼對人肝癌HepG2細胞增殖的影響及機制

張玉碧 ，呂林華 ，呂立華

1.湖南省邵陽市中心醫院血液腫瘤科，湖南邵陽 422000；2.中山大學附一院，廣東廣州 510080；3.邵陽醫學高等專科學校藥學系，湖南邵陽 422000

大蒜素是從大蒜球莖中提取的含硫化合物，具有強大的抗炎作用[1]，近年研究發現大蒜素具有防癌、抗癌的特點[2]。索拉菲尼（Sorafenib）是一種口服的多靶點、多激酶抑制劑，臨床治療肝癌療效確切，是目前晚期肝細胞肝癌（HCC）的標準治療藥物。我們通過大蒜素聯合索拉菲尼對人肝癌細胞HepG2增殖作用的影響，以期從大蒜素聯合索拉菲尼對Bcl-2基因mRNA的影響來研究其抗腫瘤作用機制，為中藥治療肝癌尋找新的突破方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器

ELX808酶標儀，美國Bio Tek公司產品。

1.2 細胞與試劑

HepG2細胞株；DMEM培養基（美國Hyclone）；小牛血清（杭州四季青公司）；二甲基亞楓（DMSO）；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT美國 Sigma)；大蒜素 （邵陽醫學高等?？茖W校藥學系，0.5 mol/ml，乙醇法提?。?，索拉菲尼（德國拜耳公司）。BCL-2基因引物由寶泰克生物技術公司合成；RT-PCR kit（寶生公司）；PCR擴增儀 （Minicvcler M7 Research）。

1.3 方法與結果

1.3.1 細胞培養 將HepG2細胞培養在含量10%小牛血清的DMEM 培養基中， 培養條件：37℃、100%濕度、5%CO2、95%空氣。每24 h換液1次。

1.3.2 MTT法檢測HepG2細胞增殖 取對數生長的HepG2細胞，以5×103/孔的密度接種于96孔板，培養24 h后加入藥物。 實驗分組：大蒜素（2、4、8、16、32 mg/L）、大蒜素 8 mg/L+索拉非尼（8 μmol/L）聯合用藥組，另設不加藥的對照組，作用于HepG2細胞。每個劑量設5個復孔，加藥后分別培養24、48、72h 后每孔加入 MTT（5 mg/m1）10 L，繼續培養 4 h。終止培養，棄上清，每孔加 150 μl DMSO，振蕩 10 min，使結晶物充分溶解，用酶標儀（波長570 nm）測定各孔的OD值，計算各組藥物對細胞增殖抑制率，抑制率（%）=1-實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.3.3 RT-PCR檢測Bcl-2基因mRNA表達 取培養24 h后的HepG2細胞，以Trizol法提取總RNA。逆轉錄和PCR擴增按RT-PCR試劑盒說明書進行，PCR擴增體系為50 μl。Bcl-2、GAPDH的引物由寶泰克生物技術公司合成。Bcl-2 mRNA探 針 序 列 ：5＇-GGAGCGTCAACAGGGGATTG-3＇，5＇-GATGC CGGTC AGGTA CTCAG-3＇上游引物和下游引物務2 μl，Taq酶 2 U，與逆轉錄產物 cDNA混勻，瞬時離心；擴增條件：94℃ 2 min、92℃ 1 min、55℃ 45 s、72℃ 1 min。 GAPDH 的引物序列：5＇-ATCAC TGCCA CTCAG GAGTC-3＇，5＇-TGAGG GAGAT GCTCA GTGTT-3＇。GAPDH 的擴增條件：95℃ 5 min，94℃ 1 min，55℃ l min,74℃ l min，25 個循環，74℃延伸 10 min。PCR產物利用2%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果。

2 結果

2.1 大蒜素聯合索拉菲尼對人肝癌細胞HepG2增殖的影響

加入大蒜素聯合索拉菲尼后，與對照組相比，肝癌細胞存活率下降，不同濃度大蒜素對HepG2細胞增殖的抑制作用，呈現明顯的時間-劑量依賴效應，見表1、圖1。

表1 MTT法檢測不同濃度大蒜素聯合索拉菲尼對HepG2細胞增殖的抑制作用（OD值，n=6）

2.2 大蒜素聯合索拉菲尼對Bcl-2 mRNA表達的影響

通過RT-PCR法檢測HepG2細胞HepG2細胞Bcl-2 mRNA表達，HepG2細胞經大蒜素、索拉菲尼、大蒜素聯合索拉菲尼作用后，以Trizol法提取總RNA，通過RT-PCR后，產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，Bcl-2基因擴增產物長度為304bp，GAPDH基因擴增產物長度為260bp。見圖2。

3 討論

原發性肝癌在我國發病率、死亡率都非常高，嚴重威脅了人民的健康和生命。索拉菲尼是目前治療晚期HCC的公認的最有效的藥物。大蒜素作為大蒜的主要有效成分，大蒜素對人肝癌HepG2細胞增殖具有抑制作用[3]，近年來成為抗腫瘤領域的研究熱點。索拉菲尼為首個獲準上市的多靶點靶向治療藥物，是一種新型多靶點信號轉導抑制劑[4]，能誘導大鼠肝細胞癌形成過程中巨噬細胞和自然殺傷細胞的聚集[5]。索拉菲尼對體外人肝癌HepG2細胞具有明顯的抑制作用，主要表現為抑制其增殖和促進其凋亡[6]。本實驗研究大蒜素聯合索拉菲尼對人肝癌HepG2細胞增殖和Bcl-2基因的mRNA表達，觀察不同時間的作用結果。

本實驗通過MTT法發現，大蒜素在濃度2~32 mg/L范圍內對人肝癌HepG2細胞增殖呈時間-劑量依賴關系 （P＜0.05)。另外，大蒜素聯合索拉菲尼降低了人肝癌HepG2細胞存活數目，表明大蒜素聯合索拉菲尼對人肝癌細胞的增殖有抑制作用。

現代研究證實，腫瘤的發生是細胞增殖與細胞凋亡失衡所致，促凋亡基因活性受抑制和抗凋亡基因被激活是導致腫瘤細胞凋亡被抑制而長期存活的主要原因[7]。Bcl-2基因是一種重要的抑制細胞凋亡的基因，廣泛存在于各種腫瘤細胞中，抑制Bcl-2基因的表達可使眾多種類的癌細胞進入凋亡，Bcl-2基因的高表達嚴重影響著腫瘤的發生、發展，并使腫瘤細胞對放療和化療產生抵抗。在肝癌、膀胱癌等癌癥中均證實Bcl-2基因的過度表達提示患者預后差[8]。Bcl-2可導致DNA受損的細胞持續生存、突變產物聚集，從而促進腫瘤的發生、發展[9]，shRNA可致HepG-2細胞凋亡，并抑制Bcl-2的表達[10]。

RT-PCR實驗結果證明大蒜素聯合索拉菲尼作用24 h后Bcl-2基因mRNA表達水平隨藥物濃度降低而上升，提示能下調HepG2細胞Bcl-2基因mRNA表達水平，這可能是其誘導HepG2細胞凋亡的重要機制之一，其詳細作用機制還需深入研究。

綜上所述，大蒜素聯合索拉菲尼對HepG2細胞的增殖抑制作用，對Bcl-2 mRNA表達的下調作用機制的闡明為肝癌治療開辟了新的途徑，值得臨床廣泛推廣。

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