女性壓力性尿失禁動(dòng)物模型的特質(zhì)研究

李晶晶，王東文

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，山西太原 030001

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是女性較為常見的一種排尿功能異常性疾病，全世界已有數(shù)千萬(wàn)婦女患有尿失禁。但SUI的發(fā)病機(jī)制尚未明確，雖然尿道支持層的支托力減弱、尿道黏膜封閉功能減退和尿道固有括約肌缺陷在發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵性已得到認(rèn)可，然而在SUI的發(fā)病過(guò)程中，哪個(gè)占有更主要的地位沒有達(dá)成共識(shí)[1]。原因主要在于用于后續(xù)研究的SUI模型不統(tǒng)一，造成研究結(jié)果的差異。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)合陰道擴(kuò)張、卵巢切除、陰部神經(jīng)切斷的方法來(lái)模擬多因素作用下SUI的發(fā)生，為SUI的基礎(chǔ)研究提供一種有效、穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室（國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）動(dòng)物中心提供40只6周齡健康雌性Wistar大鼠，平均體重約204 g，以統(tǒng)一飼料喂養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組，Ⅰ組為對(duì)照組（10只）；Ⅱ組為陰道擴(kuò)張+卵巢切除組（10只）；Ⅲ組為陰部神經(jīng)切斷組（10只）；Ⅳ組為陰道擴(kuò)張+卵巢切除+陰部神經(jīng)切斷組（10 只）。

1.2 動(dòng)物模型建立方法

1.2.1 陰道擴(kuò)張+卵巢切除+陰部神經(jīng)切斷組 用1%異戊巴比妥（0.34 ml/100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉后將大鼠俯臥位固定，備皮，消毒取骶正中1.5 cm皮膚切口和雙側(cè)背部肌肉切口，分離肌肉及周圍組織暴露坐骨直腸窩，并于坐骨直腸窩內(nèi)分離陰部神經(jīng)，兩側(cè)各離斷1.5 cm，2-0絲線依次縫合肌肉和皮膚[2]。改仰臥位固定，背骶側(cè)墊無(wú)菌紗布，下腹部備皮，消毒取正中切口1.5 cm，于膀胱后方尋及雙角子宮，沿兩側(cè)子宮角向上探及雙側(cè)卵巢，分離、結(jié)扎周圍血管及子宮角后切除雙側(cè)卵巢。40萬(wàn)U青霉素溶于1 ml無(wú)菌生理鹽水腹腔內(nèi)沖洗，2-0絲線依次縫合肌肉和皮膚。導(dǎo)尿排空膀胱后，用8F雙腔導(dǎo)尿管（頂部有氣囊）插入大鼠陰道2～3 cm，往氣囊內(nèi)注入5 ml無(wú)菌生理鹽水。陰道口前后壁縫合一針以防尿管脫落。使大鼠骶尾部緊靠桌邊，尿管下垂給予適當(dāng)?shù)睦Γs100 g）。維持該狀態(tài)4 h后拔出尿管[3-4]。

1.2.2 陰道擴(kuò)張 +卵巢切除組 大鼠用異戊巴比妥腹腔內(nèi)注射麻醉后，先俯臥位游離雙側(cè)陰部神經(jīng)不切斷，縫合各層后改仰臥位切除雙側(cè)卵巢及氣囊擴(kuò)張陰道，維持4 h。

1.2.3 陰部神經(jīng)切斷組 大鼠用10%水合氯醛 （0.3 ml/100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉后俯臥位離斷雙側(cè)陰部神經(jīng)，改仰臥位分離雙側(cè)卵巢不切除。

三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于術(shù)后3 d內(nèi)給予青霉素40萬(wàn)U/d腹腔注射預(yù)防感染。正常對(duì)照組不做任何處理。術(shù)后1、4、8周分別對(duì)四組動(dòng)物行尿動(dòng)力學(xué)檢查。

1.3 尿動(dòng)力學(xué)檢查[5-6]

尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)儀（BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)）的壓力傳感器與微量輸液泵分別外接一根硬膜外導(dǎo)管，用無(wú)菌生理鹽水充滿管道，保證管道內(nèi)無(wú)空氣。用10%水合氯醛（0.3 ml／100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉動(dòng)物后，仰臥位固定。排空大鼠膀胱后，尿道口碘伏消毒，將與儀器連接好的兩根涂有石蠟油的硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道插入膀胱，置入約3 cm。微泵以0.3 ml/min的速度開始向膀胱內(nèi)注入無(wú)菌生理鹽水；同時(shí)，尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)儀開始檢測(cè)。以尿道口出現(xiàn)第1滴液體為準(zhǔn)，記錄當(dāng)時(shí)的膀胱容量和膀胱內(nèi)壓為最大膀胱容量和漏尿點(diǎn)壓，并截取壓力曲線圖。每只大鼠進(jìn)行2次檢測(cè)，取其平均值。

1.4 噴嚏試驗(yàn)[7]

上述檢查之后，先排空大鼠膀胱，用微泵注入生理鹽水，其量為先前測(cè)出的膀胱容量的一半。剪取一段鼠須，伸入大鼠鼻孔，致其出現(xiàn)噴嚏反射。仔細(xì)觀察噴嚏時(shí)有無(wú)液體從尿道口流出。

1.5 組織學(xué)檢查

1.5.1 取材與切片制備 所有大鼠在術(shù)后8周測(cè)完尿動(dòng)力學(xué)之后取全段尿道及盆底肌群，置入10.0%中性甲醛固定12 h。常規(guī)脫水，石蠟包埋，1.5 μm 厚切片，置 70℃烤箱 15 h，低溫保存?zhèn)溆谩Ｖ苽銱E染色切片。尿道組織切片做Masson染色觀察尿道變化。

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色

1.5.2.1 主要試劑：兔抗大鼠Actin多克隆抗體（北京博奧森公司）；兔抗大鼠S-100蛋白（武漢博士德公司）；辣根酶標(biāo)記羊抗兔多聚體（北京中山公司），顯色劑為DAB（北京中山公司）。

1.5.2.2 步驟：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；3%H2O2室溫下孵育15min，清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；三蒸水沖洗數(shù)次，0.01mmol/L PBS浸泡3 min×3次；切片置于0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，高溫高壓2.5 min修復(fù)抗原；冷卻至室溫后，PBS浸泡3 min×3次；向切片分別滴加1∶100的一抗溶液 （兔抗αactin、兔抗 S-100），37℃孵育 1 h 20 min 后放至室溫；PBS 浸泡3 min×3 次； 滴加二抗，37℃孵育 30 min，PBS 浸泡 3 min×3次；滴加100μl新鮮配制的DAB顯色液，室溫暗處顯色3～5min；自來(lái)水沖洗切片，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：以PBS代替一抗進(jìn)行免疫組化染色。盆底肌組織切片中微絲及尿道組織切片中神經(jīng)細(xì)胞核陽(yáng)性區(qū)域顯色為棕黃色至棕褐色。

1.5.3 圖像分析

經(jīng)顯微攝像掃描后，將圖像輸入計(jì)算機(jī)，用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算切片免疫組化染色陽(yáng)性區(qū)域灰度或陽(yáng)性個(gè)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)SPSS 17.0軟件對(duì)各組多個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測(cè)漏尿點(diǎn)壓行重復(fù)測(cè)量的方差分析，對(duì)免疫組化結(jié)果行單因素方差分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3只大鼠在實(shí)驗(yàn)中死亡，其中Ⅱ組1只，Ⅳ組2只。Ⅱ組1只大鼠因插管損傷尿道無(wú)法進(jìn)行后續(xù)測(cè)壓，退出實(shí)驗(yàn)。最后進(jìn)入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的大鼠為36只。

2.1 尿動(dòng)力學(xué)結(jié)果

漏尿點(diǎn)壓（LPP），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，Ⅲ組和Ⅳ組的LPP顯著低于Ⅰ組和Ⅱ組（P＜0.01）；Ⅱ組 LPP 低于Ⅰ組（P＜0.05）；Ⅲ組與Ⅳ組比較LPP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 噴嚏負(fù)荷試驗(yàn)

Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別有6、9、10只陽(yáng)性，而Ⅰ組對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性。

2.3 組織學(xué)表現(xiàn)

2.3.1 尿道組織 全層尿道的HE及Masson染色 見圖1，可見Ⅲ、Ⅳ組與Ⅰ、Ⅱ組比較，尿道全層變薄，結(jié)構(gòu)不明顯，肌層萎縮。并用免疫組化檢測(cè)尿道外膜神經(jīng)細(xì)胞（S-100）含量，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，Ⅲ、Ⅳ組顯著低于Ⅰ、Ⅱ組（P＜0.01）；Ⅰ組與Ⅱ組以及Ⅲ組與Ⅳ組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3.2 盆底肌組織 切片中α肌動(dòng)蛋白（α-actin）免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性區(qū)域顯色為棕黃色至棕褐色。α-actin陽(yáng)性區(qū)域灰度：Ⅰ組為（135.56±3.38），Ⅱ組為（141.55±7.94），Ⅲ組為（152.20±4.69），Ⅳ組（165.08±7.20）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，Ⅳ組與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Ⅲ組與Ⅰ、Ⅱ組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅰ組與Ⅱ組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.139）。

表1 各組在不同時(shí)間點(diǎn)LPP測(cè)定結(jié)果（ ±s，mm Hg）

表1 各組在不同時(shí)間點(diǎn)LPP測(cè)定結(jié)果（ ±s，mm Hg）

4周1周8周Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組組別 n 10 8 10 8 29.20±3.43 25.13±4.78 15.77±2.25 15.24±4.06 28.99±2.62 22.48±3.67 17.45±2.45 13.93±2.68 27.41±2.92 23.65±3.19 16.21±3.05 12.93±3.79

3 討論

按照國(guó)際控尿?qū)W會(huì)（ICS）的定義，SUI是構(gòu)成較嚴(yán)重的衛(wèi)生及社會(huì)問(wèn)題，且客觀上能證實(shí)為不自主的尿液流出。這種常見的女性排尿功能異常性疾病發(fā)病率高，而且嚴(yán)重影響著廣大婦女的健康及生活。SUI的原因很復(fù)雜，影響因素較多，目前比較公認(rèn)的主要有年齡因素、婚育因素、既往婦科手術(shù)史、長(zhǎng)期的腹壓增高史等。但這些原因?qū)е耂UI發(fā)生的確切機(jī)制目前尚無(wú)定論，雖有很多文獻(xiàn)對(duì)建立SUI動(dòng)物模型進(jìn)行了探討，然而仍沒有提供統(tǒng)一的造模方式。SUI的發(fā)生是多因素作用的結(jié)果，目前常見的造模方式一般采取單一手段來(lái)模擬造成SUI的主要原因，沒有很好地模擬SUI的病理生理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)合陰道擴(kuò)張模擬產(chǎn)傷、切除雙側(cè)卵巢模擬雌激素水平下降、切斷雙側(cè)陰部神經(jīng)模擬尿道外括約肌功能減退三種常見的造模方法來(lái)模擬多因素作用下SUI的發(fā)生。

模擬難產(chǎn)對(duì)盆底組織造成壓迫，導(dǎo)致缺血再灌注損傷，使盆底肌肉及結(jié)締組織退變、受損而薄弱，對(duì)膀胱頸和近端尿道的支持作用下降，導(dǎo)致其下移，尿道松弛，功能性尿道變短，尿道膀胱后角消失，尿道傾斜角增大，膀胱頸部呈漏斗狀并下垂，使增高的腹壓僅傳至膀胱而較少傳遞至尿道，以致尿道壓力不能同步升高，從而引起尿失禁。研究證實(shí)膀胱尿道上含有大量雌激素受體，尿道上皮黏膜下血管叢對(duì)雌激素敏感。雌激素可改善尿道周圍血流量，增加黏膜層的厚度，進(jìn)而增加尿道閉合壓[8]；雌激素水平下降使尿道黏膜萎縮變薄、彈性下降，導(dǎo)致其封閉功能下降[9]，同時(shí)使盆底的一些膠原代謝改變，從而使盆底的支托力下降。激素水平下降還會(huì)使尿道周圍肌組織細(xì)胞凋亡率明顯升高，同樣使尿道阻力下降[10]。大鼠的陰部神經(jīng)支配尿道外括約肌（橫紋肌）和盆底肌中的尾骨肌。陰部神經(jīng)切斷使尿道外括約肌失去了神經(jīng)支配，肌肉收縮受限，造成外括約肌功能下降或消失，導(dǎo)致尿道關(guān)閉壓下降。各實(shí)驗(yàn)組大鼠的膀胱容量較正常對(duì)照組下降，但未出現(xiàn)持續(xù)漏尿、膀胱空虛現(xiàn)象，不合并真性尿失禁，只要腹壓增加時(shí)膀胱壓力能克服尿道平滑肌的阻力就能使尿液排出。

噴嚏實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)SUI造模成功與否的金標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)定漏尿點(diǎn)壓從側(cè)面反映了實(shí)驗(yàn)大鼠的儲(chǔ)尿能力[11]。Masson染色可以清楚顯示尿道周圍肌肉組織（紅色）和結(jié)締組織（綠色）的比例，同時(shí)反映尿道的整體改變。肌動(dòng)蛋白是細(xì)肌絲的主要結(jié)構(gòu)和功能蛋白，與肌絲滑行直接相關(guān) ，肌動(dòng)蛋白的減少標(biāo)志著肌細(xì)胞的萎縮和退變[12]。S-100蛋白可以反映尿道周圍神經(jīng)分布變化。用免疫組化方法測(cè)定尿道周圍S-100蛋白和盆底肌α肌動(dòng)蛋白進(jìn)一步證實(shí)造模方式對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的影響。

本研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組的儲(chǔ)尿功能均較正常組有所下降，但Ⅲ、Ⅳ組儲(chǔ)尿功能下降較Ⅱ組更明顯，且在8周內(nèi)都能保持較低的漏尿點(diǎn)壓；并且組織學(xué)檢查可見Ⅲ、Ⅳ組的大鼠尿道全層變薄，結(jié)構(gòu)不明顯，肌層萎縮，尿道周圍神經(jīng)分布減少，Ⅳ組大鼠盆底肌的肌動(dòng)蛋白含量較其他組有明顯下降。Ⅳ組噴嚏試驗(yàn)陽(yáng)性率為100%，可以說(shuō)明Ⅳ組建立雌性SUI大鼠模型可行，并且該模型穩(wěn)定、成模率高，且同時(shí)增加損傷因素的種類，從原理上與人類SUI的發(fā)生機(jī)制更為接近。

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