一種新型蛙心灌流實驗裝置

林貞賢，盧繼承

(泰山學院 生物科學與技術系，山東泰安 271021)

蛙心灌流實驗中因蛙心具有制備容易、不需恒溫、充氧及蛙心存活時間長的優點，普遍應用于生物學和醫學教學及科學研究，也是研究觀察各種生物活性物質及藥物的重要的手段之一［1－2］.實驗成敗的關鍵在于離體心臟標本存活時間和功能狀態.良好的心肌活性對實驗結果的正確性尤為重要，為彌補傳統蛙心灌流實驗中插管難度大，蛙心存活時間短的不足，我們對蛙心灌流實驗從器材到技術方法進行了改進，并取得良好的效果.

1 傳統實驗方法

目前，生理學中常采用經典的斯氏法和八木氏法.斯氏法只插單管，操作相對簡單，但需將套管從主動脈經過動脈瓣插入心室，心室收縮時灌流液進入插管，心室舒張時灌流液又回流到心室，并非心臟單方向泵血模型，勢必影響心臟的生理特性，使實驗數據的可信度降低，且插管時易造成心臟瓣膜及心肌損傷，不能觀察心臟泵血功能的自身調節，心律失常發生率高，實驗失敗率高［3］.八木氏法需要對腔靜脈和主動脈分別進行插管，與心臟血液單方向流動一致，符合心臟工作模式，不通過主動脈瓣，對主動脈瓣及心室肌的損傷機會減小，但是操作時間長，更換某種因素時不易將前一種因素徹底清除，裝置復雜、需定制、費用高，僅用于觀察前負荷、后負荷對心輸出量的影響［3］.兩種實驗方法所用插管和灌流裝置均為玻璃制品，不僅容易損壞，而且不易操作，記錄裝置都要用蛙心夾和張力換能器，對蛙心有一定的損傷，會影響蛙心收縮力和心輸出量，使實驗結果不準確.

由于上述方法存在不足，目前關于蛙心灌流實驗裝置的改進有:一種簡單、新型的主要用于蛙心灌流實驗的計滴裝置［4］和一種自制的新型計滴器［5］.這兩種改進實際上都是一種計滴裝置，心臟收縮時任氏液由動脈插管經阻力管進入計滴槽，心臟舒張時，槽內液體經靜脈插管回流入心臟，形成離體蛙心的體外循環.進入計滴槽的液滴經過兩個記錄電極瞬間，由點滴換能器轉換為方波輸入計算機顯示、記錄和計測.通過滴數的變化來判定某種因素對蛙心功能的影響，也都獲得了較好的效果，但當蟾蜍(或青蛙)心搏頻率很快、搏出量較大時，此時計滴器電路可出現滴液滯留持續連電而短路的現象.

2 新型蛙心灌流實驗裝置

我們經反復實驗研制成功一種新型蛙心灌流實驗裝置，該裝置已獲國家實用新型專利授權(專利號:ZL 200920029387.8)，該裝置具有插管容易，蛙心存活時間長，蛙心工作模式直觀性強的優點.現就有關該裝置的制作、技術方案及使用做以簡介.

2.1 新型蛙心灌流實驗裝置的制作

將一次性靜脈輸液針一端剪去注射針，在輸液管插入帶有斜面的硬塑料管(兒童口服液的吸管)，制成右動脈插管、左動脈插管和靜脈插管，在右動脈插管的一端加上流量可調的調節開關.將一次性靜脈輸液的刻度滴斗用記號筆標記刻度，在滴斗頂部打上Φ2mm左右的通氣孔和插上輸液針頭(加藥用)，制成計滴器.蛙板、2個高低調節架、4根插管、計滴器及血壓換能器組成了蛙心灌流實驗裝置，見下圖1.

2.2 新型蛙心灌流實驗裝置的技術方案

本蛙心灌流實驗裝置所采取的技術方案為:用注射器通過換能器充液管給生理壓力傳感的壓力倉充滿任氏液，讓氣泡通過左主動脈插管排凈，用動脈夾夾閉充液管.左肝靜脈(或后腔靜脈)插入靜脈插管，其接頭與刻度滴斗的下口相連，刻度滴斗的上端有加液針頭和通氣孔;右主動脈插入右主動脈插管，固定在高低調節架上，其接頭與刻度滴斗上口的調節開關相連，形成體外循環系統，固定在支架Ⅰ上;左主動脈插入左主動脈插管，其接頭與生理壓力傳感器連接，固定在支架Ⅱ上，其高度與蛙心相同，通過血壓換能器導線連接生物信號采集系統及計算機，通過計算機實時觀測及記錄改變激素和電解質對蛙心功能的影響，還可通過刻度滴斗觀察記錄滴數，記錄心輸出量.

1.高低調節架 2.右主動脈插管 3.調節開關 4.通氣孔5.加液針頭 6.刻度滴斗 7.靜脈插管 8.支架Ⅰ9.蛙板 10.左主動脈插管 11.血壓換能器 12.血壓換能器導線13.換能器充液管 14.動脈夾 15.支架Ⅱ圖1

2.3 制備蟾蜍在體心臟灌流標本

選擇體重大、精神佳的蟾蜍，雙毀髓，背位固定于蛙板上，開胸暴露心臟.辨認心室、心房、左肝靜脈(后腔靜脈)、右主動脈、左主動脈［6］.分離左、右主動脈和左肝靜脈(后腔靜脈)，用線結扎除了這3根血管以外的全部血管(主要是左、右肺靜脈)和神經.自左肝靜脈(后腔靜脈)插入充滿0.4%肝素－任氏液的靜脈插管，其接頭與刻度滴斗的下口相連.由右主動脈插入右動脈插管，其接頭與調節開關相連，形成一個在體的蛙心循環.由左主動脈插入左主動脈插管，其接頭與壓力換能器相連，用于監測改變激素和離子對心功能的影響，記錄主動脈壓、觀察刻度滴斗內的滴數記錄心輸出量.

3 結果

用此裝置觀察了前、后負荷以及激素、電解質對心輸出量的影響.結果如下:

3.1 前負荷對心功能的影響

圖2

前負荷，即心臟收縮之前承受的負荷，用刻度滴斗內液面與蛙心的距離(cmH2O)表示.固定后負荷10cmH2O不變，分別依次控制前負荷為4、5、6、7cmH2O，隨前負荷增加，心輸出量相應增加，如圖2所示.

3.2 后負荷對心功能的影響

圖3

后負荷為心臟射血所遇到的阻力.固定前負荷為4cmH2O不變，通過改變裝置中的高低調節架的高度，分別控制后負荷為10、12、14、17cmH2O，心輸出量隨之增加，當增至17cmH2O時輸出量卻減小，即此時后負荷超過最適后負荷［6］，如圖3所示.

3.3 腎上腺素和乙酰膽堿對心功能的影響

圖4

固定前、后負荷，由加液針頭處加入2～4滴腎上腺素溶液(1:5000).當觀察到心縮力加強，心率加快時，心輸出量增大，拔開調節開關上端的接口，放掉含腎上腺素的灌流液，并用任氏液反復沖洗幾次，使灌流液液面保持原來的高度，待心搏恢復正常后，加入2～3滴乙酰膽堿溶液(1:10000)后，心跳則減慢，心收縮幅度減小，心輸出量下降.表明腎上腺素可增強心泵功能，乙酰膽堿則降低，如圖4所示.

3.4 Na+、K+、Ca2+對心功能的影響

圖5

固定前、后負荷，由加液針頭處加入1～2滴0.65%NaCl溶液，心率減慢，心肌收縮活動減弱，待曲線明顯變化時，立即拔開調節開關上端的接口，并用新鮮的任氏液沖洗2～3次，待心搏恢復正常.再向刻度滴斗加入1～2滴2%CaCl2溶液，出現反應(心收縮力加強，心率加快)后，立即沖洗，換液，待恢復正常后加入1～2滴1%KCl溶液，可看到心跳明顯減弱，心肌收縮減慢［6］.Na+使心輸出量減少，Ca2+則增加，K+則減少，如圖5所示.

4 討論

該新型灌流裝置與經典的八木氏法原理基本相似，作者采用離體蛙心灌流法，用我們的裝置制成一個在體蛙心循環系統.在體心臟處于一個完整的有機體，更有利蛙心活力的保持，缺點是任一因素的干涉都會引起其他因素的改變，不能觀察單一因素對心功能的影響.本實驗利用在體在位的蟾蜍心臟，通過結扎神經消除了神經反射對心率變動的影響，其準確性與傳統的記錄方法或其他改良裝置的測量結果相一致［6－8］.

該實用新型優點一是所有插管均為塑料軟管帶硬塑料插頭，解決了八木氏插管難度大，成功率低的問題.二是蛙心記錄裝置為壓力換能器，解決了蛙心夾對蛙心的損傷，避免了為調節方位和角度反復使用蛙心夾導致蛙心尖破裂的現象.三是蛙心存活時間更長，筆者在實驗過程發現蛙心存活可長達6小時以上，從而能夠保證多個實驗觀察項目的順利完成.四是在觀察施加某種因素前后心臟功能的變化的同時，還可直接觀察到蛙心主動脈血壓變化情況，這是斯氏或八木氏離體心臟灌流實驗無法比擬的.

該實驗在充灌液體時應注意，與壓力傳感器相連的動脈插管端垂直向上，從壓力傳感器的充液管推入抗凝用肝素任氏液，使壓力感受器和動脈插管的氣泡要完全排除，因氣泡具有較大的可收縮性，可緩沖動脈血壓，影響動脈血壓的準確性.氣泡排凈后，用動脈夾夾閉充液管，除調零外不再打開.在實驗過程中，如血液不慎進入壓力傳感器中造成血凝而影響血壓的正常記錄，要夾閉動脈近心端，取下動脈插管，清洗壓力換能器再重新插管記錄血壓［8］.因兩棲類具有心搏頻率慢、搏出量小、動脈血壓較低等特點，所以每項實驗沖洗后應保持一定的前負荷和后負荷，否則動脈壓過低，信號小，增益過大，影響血壓換能器記錄結果的準確性，這是本實驗裝置的一個不足.另外，要維持刻度滴斗內一定液面，若液面低于刻度滴斗與靜脈插管的連接處，空氣易進入心臟形成氣栓，影響液體循環.

本實驗裝置也可通過觀察刻度滴斗內的液滴數來記錄心輸出量，還可以用針型電極刺入右前肢，左右后肢皮下，同步記錄標準Ⅱ導聯ECG，可同時監視蛙心心電圖，所以本套實驗裝置改進及使用仍有提高的空間.自2009年來我們實驗室均采用此新型蛙心灌流實驗裝置用于本科實驗教學，用其開展實驗具有結果準確，蛙心工作模式直觀性強，節省實驗成本的效果，還能提高學生興趣，培養學生創新能力.

［1］付鋒，張海鋒，高峰.離體心臟灌流系統今昔談［J］.生理科學進展，2010，41(3):238－241.

［2］王麗娟，王慶妍，楊春寶.獨一味對蟾蜍離體心臟功能的影響［J］.時珍國醫國藥，2010，21(1):237－239.

［3］王玉中，孫素珍，蔡智慧，等.斯氏法、八木氏法制備離體蛙心灌流標本比較［J］.衛生職業教育，2008，26(1):116－117.

［4］季淑梅，王慶山，范振中，等.介紹一種簡單、新型的主要用于蛙心灌流實驗的計滴裝置［J］.中國應用生理學雜志，2004，20(1): 95－97.

［5］王福偉，張麗華.記滴裝置在生理學循環實驗中的應用［J］.河北醫科大學學報，2002，23(5):302－303.

［6］解景田，劉燕強，崔庚寅.生理學實驗(第三版)［M］.北京:高等教育出版社，2009.

［7］王新均，何華瓊，等.微機實驗系統記錄分析前后負荷對心臟功能影響的綜合實驗研究［J］.山西醫科大學學報，2006，37(8): 876－878.

［8］崔庚寅，解景天.生理學實驗釋疑解難［M］.北京:科學出版社，2007.