銀杏內酯對過氧化氫損傷的皮層神經元和SH-SY5Y細胞親環蛋白A(CypA)表達的影響

楊俊霞，楊惠超，王東江，潘志強

1.徐州醫學院江蘇省麻醉學重點實驗室&江蘇省麻醉與鎮痛應用技術重點實驗室，江蘇徐州 221000；2.北京金康馳醫藥投資有限公司，北京 100142；3.河北省臨漳縣人民醫院胸外科，河北臨漳 056600

親環蛋白A(CypA)是親環蛋白家族主要成員，于1984年在哺乳動物細胞中首次被發現，是免疫抑制劑環孢酶素A(CyclosporinA,CsA)在細胞內的作用靶點[1]，具有肽基脯氨酸順/反異構酶活性。研究顯示，CypA在多種腫瘤細胞中高表達[2-6]，提示其與腫瘤的發生發展具有相關性。最近研究證實氧化應激和缺血時，CypA對神經元有保護作用[7-8]。

以往的研究表明，銀杏內酯(ginkgolides,Gin)對氧糖剝奪和過氧化氫損傷的神經元有良好的保護作用[9-12]，但其保護機制是否與CypA的表達有關尚未見報道。為此，本研究以過氧化氫損傷的皮層神經元為模型觀察Gin對CypA表達的影響，為進一步證實在過氧化氫損傷時Gin與CypA表達的關系，本研究還采用了過氧化氫損傷的SH-SY5Y細胞模型，進一步證實了過氧化氫損傷時，Gin對細胞的保護作用與CypA表達的關系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

Gin（長沙上禾生物科技有限公司）、DMED培養基、Neurobasal Medium、B27(Gibco,USA)、胎牛血清(杭州四季青生物公司)、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（南京建成生物L-多聚賴氨酸、MTT、胰酶(Sigma,USA)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、Tris(上海朝瑞生物技術公司進口分裝)、PVDF 膜(Bio-Rad Laboratories,USA)、抗 β-actin單克隆抗體(Sigma公司)、抗CyPA多克隆抗體 (Biomol,USA)、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔 IgG（Cell Signaling Technology,USA）免疫印跡化學發光試劑 ECL（PIERCE），Kodak 膠片(USA)，其余為國產分析純試劑。

1.2 過氧化氫損傷的皮層神經元模型的建立

取胎齡為13～15 d的ICR小鼠，無菌條件下分離出大腦皮層，在D-Hank′s平衡鹽溶液中漂洗3次，盡量剔除腦膜，剪碎后用終濃度為0.25%胰酶，37℃消化10 min，離心，棄去上清，用含15%胎牛血清的DMEM培養基制備成1.5×109cell/L密度的細胞懸液，接種于預先用L-多聚賴氨酸包被的培養板中，置37℃，5%CO2培養箱內孵育。第二天換成含2%B27的Neurobasal繼續培養，隔天換液。培養至第7天，換成無血清DMEM培養基，加入新鮮配制的 H2O2，H2O2終濃度為0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L， 各濃度 H2O2分別與細胞共同孵育2 h后測細胞活力。

1.3 過氧化氫損傷的SH-SY5Y細胞模型的建立

取指數增長期的SH-SY5Y細胞，將完全培養基換成無血清的DMEM培養基，加入新鮮配制的H2O2，H2O2終濃度為0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L， 各濃度 H2O2分別與細胞共同孵育2 h后測細胞活力。

1.4 分組和藥物處理

實驗分為對照組(Control)、H2O2損傷組（Model）和 H2O2損傷加Gin組(Gin)。Gin用1%的二甲基亞砜溶液配制(濃度為 42.4 mg/L[9-12])，加 H2O2前 12 h加入培養基,使終濃度為42.4 mg/L；對照組、H2O2組同時加入相應量的二甲基亞砜溶液。H2O2處理前去除各組原細胞培養液，換成2 ml DMEM基礎培養液，處理后即檢測細胞活力。用于Western Blot分析的細胞處理后換成完全培養基12 h后提取蛋白。

1.5 細胞存活率測定(MTT法)

MTT法檢測細胞活力的原理是利用活細胞線粒體脫氫酶將MTT鹽還原成藍紫色的甲瓚顆粒，以顆粒溶解后呈現的顏色深淺反映細胞活性。各組細胞培養于96孔培養板，經H2O2處理后，用D-Hank's液洗2遍，每孔加入1 g/L的MTT溶液100 μl，置于37℃，5%CO2培養箱中4 h，然后再加入100 μl，20%SDS，37℃孵育 20～24 h，用全自動酶標儀于 570 nm波長測吸光度值(A)，A值越大說明細胞活力越好。每組均設6個復孔，實驗重復兩次以上。

1.6 Western Blot檢測CypA的表達

將培養于96孔板的各組細胞 (處理神經元與SH-SY5Y細胞的H2O2終濃度分別為0.1、0.2 mmo/L)用冰冷的PBS洗滌兩遍，每空加入0.6 ml蛋白裂解液，刮取細胞，搜集到1.5 ml EP管，冰上放置30min，超聲粉碎細胞，13000r/min離心10min，取少量上清液用考馬斯亮藍比色法測蛋白濃度，30 μg總蛋白量分裝成一管，-20℃保存。

制膠：配制12%分離膠溶液7.5 ml(去離子水2.625 ml，Tris·HCl pH8.8 1.875 ml，29.2%Acr-0.8%Bis 3 ml，10%AP 45 μl，TEMED 15 μl)，現將上三樣混勻后，取出 0.250 ml加入 5 μl 10%AP和5 μl TEMED迅速混勻，打入板中，封底，約10 min后，加入混勻的其他成分，輕輕地在頂層加入幾毫升去離子水至玻片齊平。聚合完成(約30 min)之后，倒掉覆蓋液體，用吸水紙吸干凝膠上部的殘存液體。配制5%濃縮膠2 ml(去離子水 1.2 ml,Tris·HCl pH6.8 0.48 ml，29.2%Acr-0.8%Bis 0.25 ml，10%AP 19.2 μl，TEMED 3.8 μl)，插入梳子，小心避免混入氣泡，室溫下約15 min后聚合。

電泳：將樣品蛋白與適量上樣緩沖液混勻，100℃水浴加熱5 min。將制備好的凝膠放在電泳槽上。上下槽均加入1×電泳緩沖液，檢查是否滲漏。繼續向上槽內添加電泳緩沖液直至充滿上樣孔；拔去梳子。在加樣指導器的幫助下按次序上樣，并加上預染的標準質量蛋白質分子。濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為100 V，至溴酚蘭抵達分離膠底部后，斷開電源。切下與CypA蛋白分子量（18 kD)對應的分離膠，浸入轉膜緩沖液中待轉膜用。

轉膜：將電泳后的凝膠、甲醇浸濕過的PVDF膜(大小與分離膠相似或略大)、多孔濾墊、厚濾紙用轉膜緩沖液浸泡15min。采用BIO-RAD電泳儀，用二張厚濾紙貼于兩張多孔濾墊，將PVDF膜、凝膠夾于中間。PVDF膜朝正極，0℃、350 mA恒流轉移2 h。轉移結束后，將PVDF膜取出剪去一角以標記膜的方向，用1×TBS溶液漂洗3遍，每遍10 min。

抗原抗體反應：PVDF膜轉入一盛有5%脫脂奶粉的平皿中，室溫下搖床包被2 h。封閉結束后，將膜浸入加有一抗(抗 CypA 抗體 1：25 000 稀釋，抗 β-actin 抗體 1：10 000 稀釋)的新鮮配制的封閉液，4℃過夜。次日，用TBS溶液將膜漂洗3遍，每遍5 min。向膜的正面滴加含有二抗的封閉液，室溫搖床反應2 h。取出濾膜，TBS溶液漂洗3遍，每遍5 min，用濾紙吸干膜上液體。等量吸出ECL試劑A和B(每2 cm2膜需ECL總量0.1 ml)，混勻后滴加在膜正面5 min后，將膜上的多余液體吸干，封入保鮮膜，放入壓片盒中。

顯影：在暗室中將膠片放在PVDF膜的正面，蓋上暗盒。曝光2 min后，取出膠片放入顯影液中，待條帶出現后取出用自來水沖洗，放入定影液中。取出膠片，晾干，待拍照用。

1.7 數據處理和統計分析

采用Sigma Stat統計軟件分析數據，各組數據以均數±標準差(±s)表示，n代表樣本數。采用One Way ANOVA法對實驗結果進行統計學分析。

2 結果

2.1 H2O2對培養的皮層神經元和SH-SY5Y細胞活力的影響

分別用終濃度為 0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L 的 H2O2與細胞共同孵育2 h后檢測細胞活力（見圖1）。結果顯示：隨著濃度的增加，細胞活力逐漸下降。

神經元對照組與0.05 mmol/L組比較無統計學意義，與0.1 mmol/L 比較，P＜0.05， 與 0.2、0.4 mmol/L 比較，P＜0.01。SH-SY5Y細胞對照組與0.05 mmol/L比較無統計學意義，與0.1、0.2、0.4 mmol/L 比較，P＜0.01。

2.2 42.4 mg/L的Gin對H2O2損傷細胞活力的影響

根據圖1提示：因0.1 mmol/L的H2O2作用神經元2 h與對照組比較，P＜0.05，既能制造神經元損傷模型，對細胞損傷也不太嚴重，所以采用0.1 mmol/L的H2O2作用神經元2 h來檢驗Gin對損傷細胞的保護作用。0.1 mmol/L的H2O2作用神經元2 h與0.2 mmol/L的H2O2作用SH-SY5Y細胞2 h的細胞活力比較無統計學意義，所以采用0.2 mmol/L的H2O2作用SH-SY5Y細胞2h來檢驗Gin對損傷細胞的保護作用。加入H2O2前，42.4 mg/L的Gin與細胞共孵育12 h。圖2結果顯示：Gin能明顯抑制H2O2造成的細胞損傷，提高細胞活力。

2.3 42.4 mg/L Gin對H2O2損傷細胞CypA表達的影響

采用圖2的分組方法，H2O2作用后換上加有血清的DMEM培養12 h后提取細胞蛋白，Werstern Blot檢測CypA表達的變化（圖3A）。結果顯示，42.4 mg/L Gin預處理12 h，可提高H2O2所致的神經元和SH-SY5Y損傷細胞的CypA表達。三次獨立實驗結果經凝膠圖像分析系統進行灰度掃描(圖 3B)。

3 討論

銀杏中具有生理活性的主要化學成分為黃酮苷、萜內酯和聚戊烯醇等化合物。其中萜內酯類化合物有：銀杏內酯A、B、C、M、J及白果內酯。已證明銀杏內酯均為強的血小板活化因子（PAF）拮抗劑,EGb對PAF的拮抗作用可能與其降低腦損傷大鼠甘氨酸水平、減少PAF誘導的胞內鈣離子水平增加、減弱蛋白激酶C(PKC)激活和降低興奮性氨基酸受體功能等有關。銀杏內酯B可通過調節超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性發揮抗氧化作用。銀杏內酯B還能抑制谷氨酸對培養胎鼠皮質神經元的損傷,其機制可能是通過降低缺血時細胞內鈣水平對抗谷氨酸的神經毒性[14-15]。H2O2是一種重要的活性氧成分,參與衰老、腦缺血缺氧等神經系統疾病的發病過程。它能使膜脂質過氧化,膜脂質過氧化引起細胞外鈣內流激活磷脂酶和蛋白激酶[15]本實驗證實銀杏內酯能夠提高雙氧水造成的細胞活力降低。

多數研究表明，缺血預處理和低氧預適應能有效減輕神經元隨后的嚴重缺血缺氧損傷。這些保護作用與其調動細胞內新的蛋白質合成有關[7,13]，CypA在腦組織廣泛表達，能夠上調過氧化物還原酶活性，抑制凋亡造成的營養因子缺乏。神經元經EPO預處理時，CypA表達上調。CypA還能與鈣網蛋白結合，調節細胞內鈣濃度。且能上調SOD和谷胱甘肽轉移酶活性，從而發揮抗氧化功能，降低氧化應激引起的細胞損傷[17-23]。銀杏內酯對缺血缺氧以及氧化應激造成的神經元損傷有保護作用[9-12]。

本研究證實銀杏內酯能夠提高H2O2所致神經元及SHSY5Y損傷細胞的活力，這種保護作用與其上調CypA的表達有關。

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