苦參堿改構體X抑制鼻咽癌細胞CNE2增殖作用的實驗研究

李靜雨，唐安洲，王立升，冉 偉，謝利紅，鐘華林

廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西南寧 530021

鼻咽癌是我國最常見的頭頸部腫瘤，尤其在兩廣地區，發病率更高。目前鼻咽癌的唯一根治性治療手段是放療，但是由于腫瘤的遠處轉移和放射的局部損傷作用，給進一步改善晚期鼻咽癌患者的預后和生活質量帶來了困難[1]，因此需要越來越多的化療手段介入。苦參堿是近年受到關注的抗腫瘤成分，并且有研究表明其具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，如鼻咽癌[2]、肝癌[3]、膀胱癌[4]等，并且在臨床上的應用也非常廣泛，但是它的生物利用率并不是特別高。為了使其活性和生物利用度更高，筆者以苦參堿為先導化合物，通過化學合成方法對其結構進行改造，合成了20個結構新穎的苦參堿衍生物。苦參堿改構體X正是從中初步篩選出的具有抗腫瘤活性的成分，本實驗研究了該藥對人鼻咽癌細胞CNE2體外增殖的影響，并探討其機制，此研究尚屬首例。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人鼻咽癌細胞株CNE2由中南大學湘雅中心實驗室購得，人臍靜脈內皮細胞株購自上海生命科學院，由本實驗室接種保存。CNE2細胞和人內皮細胞株培養于含10%滅活胎牛牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養液中，置于37℃、相對濕度90%，5%CO2培養箱內培養，定期觀察，用0.25%胰蛋白酶聯合0.02%EDTA消化傳代。

1.1.2 藥物 苦參堿改構體X由廣西大學王立升教授惠贈，化學名稱14-噻吩基次亞甲基苦參堿。藥物先以無水乙醇溶解，然后用生理鹽水等體積稀釋，過濾除菌，4℃保存。其結構式見圖1。

1.1.3 試劑和儀器 RPMI-1640改良型培養液購自hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰蛋白酶購自GIBCO公司,噻唑蘭（MTT）、PBS、DMSO 購自 Sigma公司，凱基 Annexin V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒和凱基細胞周期試劑盒。培養瓶購自corninggs，CKX41型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，酶標儀（美國RT-2100型）、恒溫水浴鍋（北京市醫療設備廠）、電熱鼓風干燥箱購自上海市實驗儀器總廠，-86℃超低溫冰箱（美國Forma公司），Eppendorff 58108型高速冷凍離心機（德國Eppendorff公司），2300型CO2培養箱（美國Shellab公司），EPICSXL流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司），SCV4A1型超凈工作臺（新加坡ESCO公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞形態觀察 細胞接種于25 ml培養瓶中，于對數生長期加苦參堿改構體藥液，濃度為 25、50、100、200、400 mg/L，24 h后倒置顯微鏡下觀察，放大倍數分別是10×20和10×40。

1.2.2 細胞毒性實驗（MTT法）取對數生長期CNE2細胞和人內皮細胞按每孔6×103個細胞接種于96孔板中，于第2天下午加入不同濃度的苦參堿改構體藥液，濃度分別為25、50、100、200、400 mg/L，并加入相應比例完全培養基共 200 μl；另設溶劑組、陰性對照組、空白對照組（調零孔），除完全培養基、MTT、二甲基亞砜外，其中溶劑組加無水乙醇的生理鹽水等體積稀釋液、完全培養基、細胞，陰性對照組加細胞，調零孔只加完全培養基、MTT和二甲基亞砜。每個濃度均設4個復孔，于終止前4 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，繼續孵育4h后棄去上清液，加入150μl二甲基亞砜，輕輕振蕩10min，使結晶物完全溶解，于570 nm波長處在熒光酶聯分析儀上測光吸收值（A 值），計算抑制率（IR）。IR（%）=（對照孔 A 值-實驗孔A值）/對照孔A值×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期分布和細胞凋亡 細胞接種于25 ml培養瓶中，于對數生長期加苦參堿改構體藥液，濃度為 25、50、100、200、400 mg/L，并加入相應比例完全培養基至5 ml，24 h后依據試劑盒說明書收集細胞送檢。以增殖指數分析細胞的增殖活性：PI=（S期細胞數+G2/M期細胞數目）/三期細胞數目總和。

1.3 統計學方法

采用 SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料均數±標準差（±s）表示。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

見圖 1～3。

如圖1所見，未干預細胞貼壁生長，呈延展和扁平，細胞均質而透明，核膜核仁輪廓明顯，細胞間結構緊密，生長旺盛。在藥物干預之后，如圖2、3可見細胞膜完整但出現發泡現象，貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落，隨濃度遞增表現愈明顯。

2.2 細胞毒性試驗結果（MTT）

由表1可見隨著加藥濃度增加，苦參堿改構體對鼻咽癌細胞的生長均具有明顯抑制作用，最大可達97.9%，經SPSS[5]可求得改構體對細胞株CNE2的IC50為（106.378±0.825）。而由表2可見，對于人臍靜脈內皮細胞苦參堿改構體基本上沒有抑制作用，排除溶劑的干擾，其抑制率最大僅7.7%，遠遠低于同濃度處與CNE2的抑制率，故可以認為苦參堿改構體的具有特異性抗腫瘤作用。

2.3 細胞周期分布

用流式細胞儀分析五個濃度梯度的苦參堿改構體藥液對鼻咽癌細胞株CNE2周期改變的影響。其中，對照組S期比例為15.69%、增殖指數為28.7，加藥組的S期比例由25～400 μg/ml分別為 19.66%、28.15%、22.60%、29.28%、29.07%，對照組明顯低于各個濃度的加藥組，可見該藥通過細胞周期抑制腫瘤細胞增殖的調控點很可能就在S期。

表1 不同濃度苦參堿改構體作用48 h后對人鼻咽癌細胞株CNE2的增殖影響

表2 不同濃度苦參堿改構體作用48 h后對人內皮細胞的增殖影響

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

濃度在25、50 μg/ml處已開始出現凋亡，凋亡率分別為27.28%、28.69%；100、200 μg/ml處明顯出現凋亡， 細胞凋亡超過了50%；濃度為400 μg/ml時凋亡率已達到89.71%，表現出了很強的抑制作用。

3 討論

苦參堿是純天然生物堿類藥物，其制劑已廣泛用于治療慢性肝炎和肝纖維化，并表現出了一定的抗癌作用，針對其抗腫瘤特點加強相關衍生物和新制劑的研究，可以充分發揮傳統中藥的抗腫瘤特性[6]。研究所用苦參堿改構體X由廣西大學化學化工學院王立升教授惠贈，實驗通過倒置顯微鏡觀察細胞形態變化、MTT檢測藥物抑制率、流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡，筆者發現苦參堿改構體有很強的腫瘤抑制作用，并且不損傷正常細胞。李海英等[2]研究苦參堿抗鼻咽癌細胞CNE2作用時，其48 h IC50為710 μg/ml，而此改構體為（106.378±0.825） μg/ml，僅為苦參堿的七分之一，其抗鼻咽癌藥效遠遠強于苦參堿。

細胞周期是細胞的基本生命活動，許多化療藥物就是通過阻滯正常細胞周期的激活靶點，達到抑制腫瘤細胞的分裂增殖的目的[7]。本實驗通過流式細胞儀檢測細胞加藥前后細胞周期時相分布結果顯示：苦參堿改構體處理細胞24 h后，各濃度組的細胞周期S期細胞含量與對照組相比明顯增加（P＜0.05），隨濃度遞增含量亦隨之增加，表現出細胞被阻滯于S期，從而抑制細胞分裂，參與完成其細胞增殖抑制作用。實驗通過流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示：與對照組相比，各濃度組具有明顯的促進凋亡作用（P＜0.05），其凋亡率表現出了劑量依賴性，并與細胞周期S期細胞含量大小一致。流式細胞儀結果結合細胞形態變化示此苦參堿改構體有體外誘導鼻咽癌細胞株CNE2凋亡的作用。

細胞周期作為一個抗腫瘤藥物作用的新靶點正在被越來越多的研究者關注和認可[8-9]，被認為可以最大限度地減少耐藥、突變及毒性的發生機會[10]，通過本實驗筆者發現苦參堿改構體可以明顯地阻滯細胞增殖于S期，表現出顯著的促細胞凋亡作用，而且不損傷正常細胞。為提高藥物的抗腫瘤活性和選擇性作用，還需要進一步從分子水平探討其對細胞周期和細胞調控機制的影響，并找出其具體的作用靶點，從而在整體上了解其作用機制。

[1]羅京偉,徐國鎮.鼻咽癌治療的進展.[J].中華耳鼻咽喉科雜志,2004,39(8)：509-512.

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[3]程少冰,趙昌林.苦參堿誘導人肝癌細胞株HpG2-2-15凋亡的實驗研究[J].時珍國醫國藥,2010,21(5)：1123-1125.

[4]單廣夷,盛玉文.苦參堿對人膀胱癌EJ細胞株凋亡的影響及機制[J].山東醫藥,2010,50(11)：43-45.

[5]趙斌,葛金芳,朱娟娟,等.小議在MTT法測細胞增殖抑制率中IC50的計算方法[J].安徽醫藥,2007,11(9)：834-835.

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