人乳頭瘤病毒16 E6蛋白與人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在乳腺癌中的表達及意義

李 博，黃 河，趙 瑛

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科，山西太原 030001

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，但目前有關(guān)乳腺癌發(fā)生的確切病因及機制仍未闡明，已知的高危因素只能解釋一部分的病例。人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）特別是高危HPV16病毒是一種腫瘤相關(guān)病毒，但其與乳腺癌發(fā)病的相關(guān)性研究結(jié)果在不同報道的差異較大。近年來，研究顯示端粒酶的結(jié)構(gòu)和行為異常被認為與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究采用隨機對照實驗來探討HPV16 E6蛋白及人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性，并初步探討其機制，為乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的研究提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

隨機抽取山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年1月～2010年8月經(jīng)手術(shù)切除術(shù)后病理證實的女性乳腺癌組織材料40例及正常乳腺組織20例。年齡32～70歲，平均53.2歲。其中1例為浸潤性導(dǎo)管癌合并Paget病，其余均為浸潤性導(dǎo)管癌。

1.2 試劑與方法

HPV16 E6 （bs-0990R） 兔抗人抗體及 hTERT（bs-1411R）兔抗人抗體購自北京博奧森生物技術(shù)公司，S-P試劑盒（兔PV-6001）購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

HPV16 E6及hTERT一抗稀釋度均為 1∶200，HPV16 E6需作EDTA高壓抗原修復(fù)，hTERT需作枸櫞酸鹽高壓抗原修復(fù)，按S-P試劑盒操作步驟染色，用已知陽性片作陽性對照，用磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液）代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷標準

HPV16 E6和hTERT以細胞核呈棕黃色著色為陽性表達。計數(shù)≥500個腫瘤細胞，以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒且陽性細胞數(shù)≥10%為（+），＜10%為（-）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行 χ2檢驗和Spearman等級相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV16 E6及hTERT在乳腺組織中的表達

HPV16 E6及hTERT陽性棕黃色顆粒在乳腺癌組織中定位于癌細胞核內(nèi)，正常乳腺組織中定位于導(dǎo)管上皮細胞核內(nèi)，灶狀或彌漫分布，肌上皮細胞核及間質(zhì)內(nèi)無陽性著色，背景清晰。見圖1～4。

2.2 HPV16 E6及hTERT在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達

在40例乳腺癌組織中，有22例HPV16 E6蛋白表達呈陽性，有23例hTERT蛋白表達呈陽性。在20例正常乳腺組織中，有2例HPV16 E6蛋白表達呈陽性，1例hTERT蛋白表達呈陽性。乳腺癌組與正常乳腺組織組HPV16 E6蛋白陽性表達情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.80＞3.84，P＜0.05）。乳腺癌組與正常組hTERT蛋白陽性表達情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=16.20＞3.84，P＜0.05）。 見表1、2。

表1 乳腺癌及正常乳腺組織中人乳頭瘤病毒16 E6蛋白的表達情況（例）

表2 乳腺癌及正常乳腺組織中人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白的表達情況（例）

2.3 HPV16 E6與hTERT在乳腺癌中的相關(guān)性分析

在22例HPV16 E6蛋白表達陽性的乳腺癌組織中，有16例hTERT蛋白表達呈陽性。根據(jù)相關(guān)性分析，HPV16 E6與hTERT在乳腺癌中的表達呈顯著性相關(guān)（r=0.341，P＜0.05）。見表3。

表3 乳腺癌中人乳頭瘤病毒16 E6蛋白與人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白表達情況

3 討論

1990年Band等[1]應(yīng)用HPV16基因在體外誘導(dǎo)出乳腺導(dǎo)管上皮細胞永生化后，從此開始了人們對HPV在乳腺癌作為促癌因子或致癌因子方面及其發(fā)病機制的研究。本研究的結(jié)果顯示，部分癌組織和正常乳腺組織中均有HPV16感染的存在，而且乳腺癌組織中HPV16 E6的陽性表達顯著高于正常乳腺組織，表明HPV16型的感染可能與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。Wang等[2]進行的HPV16的E6轉(zhuǎn)基因鼠的研究，證實了攜帶有HPV16 E6基因的小鼠能夠發(fā)生乳腺部位的腫瘤。國內(nèi)研究報道[3]指出HPV16 E6和E7基因共存于部分乳腺癌組織中，HPV16可能是乳腺癌發(fā)病的病因?qū)W因素之一。

乳腺癌組中hTERT的陽性表達顯著高于正常組，表明hTERT可能與女性乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。雖然人類腫瘤細胞中廣泛存在較高的端粒酶活性，甚至在一些腫瘤中端粒酶活性高低與惡性程度一致，但端粒酶自身并沒有能力引起腫瘤[4]。要維持腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化，就需要更高的端粒酶水平來更有效地維持端粒的長度，這往往要求端粒酶的重新激活。端粒酶在乳腺癌細胞的發(fā)生、發(fā)展中起到一定的作用，可以將端粒酶作為一種新的腫瘤標記，通過對細胞端粒酶的檢測來協(xié)助乳腺癌的診斷[5]。

在22例表達HPV16 E6蛋白的乳腺癌中，有16例表達hTERT蛋白，且根據(jù)相關(guān)性分析證明在乳腺癌中二者表達具有相關(guān)性，表明在乳腺癌中HPV16 E6可能通過某種途徑再激活了hTERT，從而導(dǎo)致了乳腺癌的發(fā)生。Veldman等[6]研究發(fā)現(xiàn)，E6癌蛋白在人角化上皮細胞中能使hTERT啟動子的活性增加6.5倍，而此作用主要與hTERT上的251bp（-211～ +40）片段有關(guān)，其中的 35bp（5～40）片段與60%的E6癌蛋白有關(guān)。目前有研究表明[7]，高危型HPV E6蛋白的轉(zhuǎn)化功能是通過E6與E6AP的相互作用，降解腫瘤抑制因子p53。HPV E6的C端介導(dǎo)了與PDZ蛋白的直接結(jié)合。C末段序列的缺失會抑制E6介導(dǎo)的小鼠細胞惡性轉(zhuǎn)化和鼠模型系統(tǒng)中上皮細胞過度增生，說明E6與PDZ結(jié)合在HPV相關(guān)性致癌作用中起重要作用。最后，HPV E6通過改變hTERT的表達，提高端粒酶的活性，通過延長染色體末端延長細胞的生存周期[8]。說明E6是高危型HPV的一個重要的致癌基因，其編碼的E6蛋白不具有內(nèi)在酶活性，但它可通過直接或間接與各種靶蛋白相互作用，如通過抑制P53和PDZ蛋白家族的活性從而增強端粒酶活性致癌。Klingelhutz等[9]用HPV16 E6蛋白作用于早期人角質(zhì)細胞和哺乳類上皮細胞，發(fā)現(xiàn)E6蛋白可以激活端粒酶，并且E6蛋白激活端粒酶是p53非依賴性。從而可以知道，HPV感染是啟動因子，通過各種途徑導(dǎo)致端粒酶重新激活，使細胞獲得無限增殖能力。

從目前的研究來看，HPV轉(zhuǎn)染細胞成為永生化細胞要經(jīng)歷2個階段：第一階段細胞生命期延長，細胞持續(xù)增殖，端粒長度進行性縮短；第二階段細胞永生化階段，細胞激活端粒維持機制，獲得無限增殖的潛能。在乳腺癌的病毒癌發(fā)生機制中，HPV病毒再激活端粒酶的具體途徑還有待進一步探討。

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