創面修復中骨橋蛋白和表皮生長因子受體表達變化的實驗研究

隋志甫 ，劉靜杰 ，谷廷敏 ，李 蠡 ，趙志力 ，閻曉輝

1.解放軍北京軍區總醫院美容整形中心，北京 100125；2.海軍總醫院整形外科，北京 100048

隨著細胞生物學、分子生物學和生物化學的深入發展，人們對創傷修復的認識不斷豐富和深化。OPN是一種磷酸化糖蛋白，作為一種炎癥因子，參與了多種組織的病理性纖維化過程，最近的研究發現抑制ICR小鼠OPN的表達可加速其皮膚創口愈合，并減少肉芽組織及瘢痕的形成[1-2]。EGFr作為表皮生長因子的受體具有促進表皮細胞增殖和爬行、促進成纖維細胞增殖和增加膠元合成等獨特的生物學作用[3]。既往動物試驗提示OPN和EGFr與創面愈合過程明顯相關，為了解其相關性的普遍意義，筆者采用免疫組化與原位雜交學方法觀察燒傷患者創面中OPN和EGFr的表達變化，分析并探討OPN和EGFr在臨床創面修復過程中的作用。

1 資科與方法

1.1 標本來源及制備

自2008年6月～2010年6月選取大面積燒傷患者，平均燒傷面積為（32.5±4.2）%TBSA，創面中的淺Ⅱ度創面，共15例，男10例，女5例；年齡19～43歲，創面位于下腹部和大腿，經組織學證實均為淺Ⅱ度創面，患者無特殊疾患。每一病例經知情同意后， 分別于傷后 1、3、5、7、9、11 d 時于局麻下用眼科角膜環鉆切取包括創面、創基及少量皮下脂肪在內的標本，選取植皮手術時取皮區的正常皮膚作為對照，分別置于10%中性福爾馬林和4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成5 μm的組織切片備用。

1.2 OPN和EGFr檢測

①OPN檢測：切片二甲苯脫蠟2次，每次10 min；梯度乙醇水化，0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min；3%過氧化氫室溫孵育30 min，0.01 mol/L PBS浸洗；0.1%胃蛋白酶37℃孵育10 min，0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min；滴加5%BSA，37℃封閉30 min，吸去多余液體。鼠抗人OPN單克隆抗體（1∶100）（美國SANTA CRUZ公司）37℃孵育1 d，經0.01 mol/L PBS浸洗后滴加生物素化羊抗鼠IgG（美國SANTA CRUZ公司），37℃孵育30 min后，0.01 mol/L PBS清洗，滴加SABC，37℃下孵育30 min，再次經0.01 mol/L PBS清洗，以二氨基聯苯氨（DAB）顯色，鏡下控制反應時間，蘇木精輕度復染，常規脫水、透明、封片，同時設無一抗的空白對照。顯微鏡下觀察，陽性顆粒為棕色。②EGFr檢測：用地高辛標記EGFr的cDNA探針后進行組織切片的原位雜交，組織切片脫蠟入水，0.2 mol/L鹽酸酸化，蛋白酶K消化，酒精脫水，置預雜交液（42℃）預雜交4 h，入雜交液雜交（42℃）17 h后用Boegringer Mannheim公司產品Dig-DNA labelling and detection試劑盒觀察切片中EGFr活化表達的mRNA的變化情況。顯微鏡下觀察，陽性顆粒為棕黃色。400倍光鏡下測定其相對含量，每組選擇5張切片，每張切片連續記數5個視野，求出每個視野內陽性顆粒平均數。 陰性（-）：視野內無陽性信號；弱陽性（+）：視野內可見10個以下陽性信號；中等陽性（++）：視野內可見11～30個陽性信號；強陽性（+++）：視野內可見大于30個陽性信號。

1.3 統計學處理

應用SPSS 13.0統計軟件處理組間變化，進行方差分析，組間行Student's t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

實驗結果顯示，燒傷能誘導創面組織OPN和EGFr的表達，但二者表達不盡相同。在正常皮膚中，OPN陽性顆粒細胞分布于毛囊、汗腺及皮脂腺，在表皮及真皮部分均無分布，表達強度（-）。燒傷后第1天起OPN陽性顆粒廣泛分布于真皮層成纖維細胞的胞漿中及毛囊、汗腺及皮脂腺周圍，但呈松散稀疏分布；在第3天時這種分布最為密集，OPN表達強度最高（+++），隨后的5～7 d其表達強度逐步減弱。正常皮膚內EGFr僅有弱陽性表達（+），燒傷后第1天起EGFr的表達逐漸增加，在傷后7 d時達峰值，呈強陽性表達（+++），此后逐漸下降，其陽性顆粒主要分布于表皮基底細胞胞漿、真皮成纖維細胞的胞核內及毛囊、汗腺及皮脂腺周圍。傷前OPN和EGFr陽性顆粒表達數量與傷后表達高峰期自身對比差異均有高度統計學意義（P＜0.01）。見表1、圖1。

表1 創面修復過程中骨橋蛋白和表皮生長因子受體表達強度

3 討論

皮膚創傷愈合的基本過程可以分為三個連續或者重疊的時期：炎癥期、細胞外基質沉積期及組織改建期。這一過程有多種細胞因子、各類型的細胞和細胞外基質共同參與[4-5]。這些細胞因子如果調控失常會干擾正常的組織修復過程而出現愈合過慢形成潰瘍或者愈合過度形成瘢痕[6]。骨橋蛋白是一種磷酸化糖蛋白，在1985年，Franzen等[7]在大鼠礦化的骨基質中分離出一種含“精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸”序列（RGDsequence）的磷酸化糖蛋白，命名為骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）。隨后的研究發現OPN廣泛存在于多種組織中，包括腎、膽囊、肺部、乳房、腸胃以及尿道[8-9]。此外，OPN作為一種炎癥因子，參與各種組織的病理性纖維化過程，在多種腫瘤組織內也發現OPN的表達[10-11]。在皮膚創口愈合方面，最近的研究發現抑制ICR小鼠OPN的表達可加速其皮膚創口愈合，并減少肉芽組織及瘢痕的形成，但其內在機制有待進一步研究。本實驗顯示，在正常皮膚的表皮及真皮部分均未檢測到OPN陽性顆粒，在毛囊、汗腺及皮脂腺周圍可見散在分布。燒傷后第1天起OPN陽性顆粒廣泛分布于真皮層成纖維細胞的胞漿及毛囊、汗腺、皮脂腺周圍，但呈松散稀疏分布；在第3天時這種分布最為密集，OPN表達強度最高，隨后的5～7 d其表達強度逐步減弱。可以看出OPN表達的高峰期與細胞外基質沉積的高峰期一致，推測OPN可能參與了創面修復初期的細胞外基質的沉積，從而影響創面愈合。表皮生長因子（EGF）、EGFr蛋白在調控組織細胞的增殖方面有很重要的作用，各種刺激引起EGF、EGFr蛋白表達后，組織中相應的細胞因子增多，從而促進細胞分裂增殖和創傷的愈合[12]。EGFr是多細胞生物中介導EGF發揮其生物學效應的關鍵成分，EGF只有與其靶細胞膜表面的EGFr結合才能發揮其生物學作用。本研究結果表明：正常皮膚內EGFr僅有弱陽性表達，燒傷后第1天起EGFr的表達逐漸增加，陽性顆粒多數分布在創緣上皮、創面表面的細胞、真皮淺層成纖維細胞、皮脂腺、汗腺、毛囊周圍，傷后7～9 d EGFr表達量最多，表達最強，傷后3～5 d次之，傷后11 d進一步減少。這可能是傷后早期創面組織細胞對創傷刺激尚無明顯反應，EGFr合成較少；傷后7～9 d時組織細胞對創傷刺激反應明顯增強，EGFr合成增多；傷后11 d以后，創面縮小，組織細胞自我調節，降低了反應性，因此EGFr蛋白合成下降，這與機體為避免組織過度增生所產生的“接觸性抑制”相一致[13]。

創面修復是一個多種因素參與的復雜生物過程，本研究顯示：在整個臨床創面修復過程中，特別是創面修復的初、中期，OPN和EGFr均有明顯的表達，且分布范圍多數在創面修復細胞增殖的活躍部位（表皮或真皮層成纖維細胞的胞漿或胞核、毛囊、汗腺、皮脂腺等），這與以往動物實驗的結果相似，這種表達的時相性和區域性分布特點表明OPN和EGFr參與了臨床創面修復的各時期（特別是初、中期）的細胞代謝和增殖。提示我們如果在臨床創面修復的不同時期采取措施，合理調控OPN和EGFr的表達，將有助于加快創面愈合，減少瘢痕形成。

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