胰腺大部切除法制作大鼠高血糖模型的實驗研究

李 勇 ，章樂虹

1.四川省雅安市人民醫(yī)院普外科，四川雅安 625000；2.廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院普外科，廣東廣州 510260

目前，糖尿病及其并發(fā)癥的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，進(jìn)一步深入探討糖尿病發(fā)病機(jī)制及治療方式有賴于理想的動物模型的建立。因而，研究臨床糖尿病前期機(jī)體的相關(guān)變化及代償情況無疑能為進(jìn)一步探索糖尿病發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療方法提供更多的資料。為此，本文設(shè)計使用胰腺大部切除法制作大鼠高血糖模型，并對制作方法及相關(guān)生化、形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

實驗動物：清潔級SD大鼠60只(雌雄不拘，廣州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，體重(200±30)g。大鼠隨機(jī)分為三組：胰腺切除加高糖飲食組（P+H組，n=30）；胰腺切除組（P組，n=20）；假手術(shù)加高糖飲食組（H 組，n=10）。

1.2 實驗方法

胰腺切除加高糖飲食組（P+H組）行胰腺大部切除術(shù)，按3.5 ml/100 g體重，使用10%水合氯醛作大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉后，無菌狀態(tài)下開腹，切除大鼠胰腺＞90%，切除范圍包括大網(wǎng)膜、脾臟及十二指腸曲中大部分胰腺組織。術(shù)后肌肉注射青霉素5萬U/100 g三次，并予高糖飲食飼養(yǎng)（基礎(chǔ)飼料為常規(guī)飼料，蛋白、脂肪、糖的比例分別為23.4%、4.4%、54.6%，予20%糖水作為飲用水）。胰腺切除組（P組），手術(shù)及基礎(chǔ)飼料同胰腺切除加高糖飲食組，但飲用水中不加糖。假手術(shù)高糖飲食組（H組），開腹后不切除胰腺僅作脾臟切除，其余處理同胰腺切除加高糖飲食組。

1.3 觀測指標(biāo)

血糖變化：三組大鼠均于術(shù)后每24小時使用微量血糖儀測定空腹末梢血糖（尾部或耳部針刺取血），連續(xù)三次，72 h后每周測量一次直至術(shù)后第12周，測量前大鼠禁飲食（清晨起禁食）8 h。術(shù)后2 d起，連續(xù)二次空腹血糖（FBG）≥7.0 mmo1/L且無連續(xù)二次空腹血糖≥16.67 mmo1/L為高血糖模型，出現(xiàn)連續(xù)二次FBG≥16.67 mmo1/L為糖尿病模型[1-4]。

血胰島素及體重變化：每15天斷尾取血使用固相放免法（北京東亞免疫技術(shù)研究所提供）測胰島素同時稱量體重變化。

糖耐量反應(yīng)：術(shù)后30 d，取三組大鼠測定空腹血糖后即按體重0.5 g/100 g灌喂葡萄糖，隨后分別測定0.5、1.0、3.0 h血糖。

HE染色：取正常及病程不同階段大鼠胰腺、肝、腎組織常規(guī)脫水、透明、包埋制成石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。

免疫組化檢測：抗胰島素抗體，用SABC法（一抗及試劑盒均由武漢博士德公司提供）對大鼠胰腺石蠟切片進(jìn)行染色，檢測beta細(xì)胞數(shù)量及功能。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 血糖變化

三組大鼠血糖隨時間的變化關(guān)系見表1。其中P+H組20只大鼠術(shù)后72 h死亡2只，以后死亡1只（術(shù)后腸梗阻），成糖尿病模型（出現(xiàn)連續(xù)二次FBG≥16.67 mmo1/L）4只，其余13只均成高血糖模型，成高血糖模型率65%，成糖尿病模型率20%。單純胰腺切除組（P組）在術(shù)后24 h也同樣出現(xiàn)明顯血糖升高，前48 h空腹血糖與P+H組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，但術(shù)后72 h起血糖即逐漸下降至接近正常水平，未出現(xiàn)糖尿病模型，有三只成高血糖模型，成高血糖模型率15%。假手術(shù)高糖飲食組（H組）術(shù)后空腹血糖變化不明顯，未出現(xiàn)糖尿病模型及高血糖模型。整個實驗過程中成模動物無致死性低血糖等的發(fā)生，均未使用胰島素治療。

表1 三組大鼠胰腺大部分切除后血糖情況（mmol/L）

2.2 空腹血胰島素水平變化

三組大鼠胰島素水平隨時間的變化關(guān)系見表2。P+H組血胰島素水平最低、H組則最高、P組介于兩者之間。兩兩均數(shù)的t檢驗顯示P+H組與P組及H組比較有顯著性差異（P＜0.01），而P組與H組比較亦低于H組且有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。

2.3 糖耐量反應(yīng)

術(shù)后2個月，三組大鼠糖耐量反應(yīng)結(jié)果見表3，示P組對糖刺激耐受低于H組，給糖前兩者血糖濃度無顯著性差異，但給糖后30、60、180 min P組血糖濃度均高于H組（P＜0.01）；而P+H組血糖則始終高于另兩組。

表2 三組大鼠胰腺大部分切除后血胰島素變化情況（mU/L）

表3 三組大鼠胰腺大部分切除術(shù)后2個月糖耐量試驗結(jié)果（mmol/L）

2.4 HE染色結(jié)果

P+H組（圖1）高血糖模型大鼠胰島有不同程度萎縮、體積縮小，未見明顯胰島纖維化及胰島分布稀疏等改變，在糖尿病模型大鼠中也出現(xiàn)類似改變。P組（圖2）可見胰島體積增大，胰島細(xì)胞肥大。H組中也見部分大鼠胰島呈類似改變。

2.5 免疫組化檢測結(jié)果

P組及H組在術(shù)后3個月beta細(xì)胞的胰島素染色較P+H組增強(qiáng)，beta細(xì)胞數(shù)量亦較后者為多（圖3～5）。

3 討論

國內(nèi)外糖尿病模型大致分為實驗性和自發(fā)性糖尿病模型，前者多采用鏈脲霉素（STZ）等胰島損傷性藥物制備。但是，糖尿病本身的類型多樣，除原發(fā)性糖尿病外，胰腺損傷、內(nèi)分泌疾病、藥物、感染等多種因素均可致繼發(fā)性糖代謝異常，而這些病變則難以用前述模型模擬。并且，糖尿病發(fā)病過程是一個漸進(jìn)、連續(xù)的過程，出現(xiàn)臨床癥狀的糖尿病已是機(jī)體代償機(jī)制不足以彌補(bǔ)各種病理因素作用的累積結(jié)果。

3.1 動物糖尿病模型制作方法

目前，國內(nèi)外對實驗動物糖尿病模型的制備多使用化學(xué)藥物（鏈脲霉素、四氧嘧啶等）引起胰島beta細(xì)胞損傷來完成，按不同的濃度及給藥方式可以模擬出類似體內(nèi)1、2型糖尿病環(huán)境[1-4]。對手術(shù)切除法制模在不同的文獻(xiàn)報道有差異，有認(rèn)為手術(shù)切除加高糖飲食刺激可制備繼發(fā)性永久性糖尿病模型，國外報道則多是對有遺傳易感性的肥胖大鼠行胰腺大部分切除而獲得[2,5,6]。本實驗采用胰腺切除加高糖飲食法，對手術(shù)切除范圍有所改進(jìn)，因大鼠胰腺分布散在，按常規(guī)切除脾臟下至十二指腸部位的胰腺范圍不足，且胰腺與脾臟關(guān)第緊密，若保留脾臟則可能增加術(shù)中損傷血管出血的風(fēng)險且影響切除范圍。因此我們選擇切除包括大網(wǎng)膜、脾臟及十二指腸曲中大部分胰腺組織，同時剔除位于膽總管外側(cè)胰腺的手術(shù)方式，這樣可以確保有足夠的切除范圍（90%～95%）。手術(shù)死亡率為10%，比傳統(tǒng)切除范圍的死亡率[7]（5%）稍高。在使用高糖飲食上，因大鼠高糖飲食配方及制作過程較復(fù)雜，故在使用基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上以含20%葡萄糖的自來水作飲用水替代，此飼料中并無高脂食物的影響且制作及使用簡單。制模結(jié)果看，單純胰腺切除組（P組）在術(shù)后48小時內(nèi)血糖均明顯升高，但術(shù)后72 h起又漸下降至接近正常水平，觀察3個月內(nèi)無糖尿病模型產(chǎn)生，出現(xiàn)高血糖模型率僅15%。在隨后的糖耐量試驗中P組則顯示胰島素儲備不足，對糖刺激的耐受力差，這與其它文獻(xiàn)報道結(jié)果相近[5,7]。這說明大鼠對物理性的胰島素不足有較強(qiáng)的代償和調(diào)節(jié)能力，在常規(guī)飲食情況下能較快恢復(fù)血糖穩(wěn)定，但對突發(fā)的高糖飲食刺激則缺乏足夠的耐受和調(diào)控能力。故即使擴(kuò)大切除范圍至90%～95%，單純胰腺大部切除也只能導(dǎo)致短時間的大鼠血糖升高，因而該方法不適宜作高血糖動物模型制備但可作糖耐量異常的動物模型制備。在胰腺切除加高糖飲食組（P+H組）術(shù)后即出現(xiàn)血糖升高，觀察3個月內(nèi)血糖始終維持在較高水平，成高血糖模型率65%，成糖尿病模型率20%，術(shù)后胰島素濃度較另兩組均偏低（P＜0.05,糖耐量反應(yīng)也低于假手術(shù)高糖飲食組（H組）。表明在胰腺大部分切除的基礎(chǔ)上，持續(xù)的高糖飲食刺激可抑制大鼠胰島beta細(xì)胞的代償和調(diào)節(jié)能力，從而形成高血糖狀態(tài)。因本實驗所測血糖均為空腹血糖且據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[1,2,6,8,9]報道當(dāng)大鼠血糖濃度持續(xù)≥16.67 mmo1/L時即可產(chǎn)生對胰島細(xì)胞的損害作用，故我們也選擇以連續(xù)兩次血糖濃度≥16.67 mmo1/L作為判斷是否構(gòu)成糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)。本實驗多數(shù)大鼠只形成穩(wěn)定的高血糖模型而未達(dá)到糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)，這可能與使用加糖飲水替代的高糖飲食對胰島細(xì)胞的攻擊弱于傳統(tǒng)高糖飲食以及地域差異和觀察時間還不足夠長有關(guān)。但這一穩(wěn)定的高血糖大鼠模型正好為研究臨界糖尿病前期病理生理改變及可能的藥物和治療方法干預(yù)提供良好的實驗對象。

3.2 胰腺大部切除及高糖飲食對胰島細(xì)胞的影響

本實驗對三組受試對象殘余胰腺組織的病理標(biāo)本及免疫組化分析顯示，在單純胰腺大部切除或單純高糖飲食作用下，在實驗觀察期內(nèi)可見胰島有不同程度肥大、增生，beta細(xì)胞的胰島素染色增強(qiáng)、增多。而在胰腺大部分切除的基礎(chǔ)上加用高糖飲食刺激組（P＋H組）則出現(xiàn)相反的改變，部分胰島有萎縮、體積縮小，beta細(xì)胞胰島素染色也弱于P組及H組，這在成糖尿病模型大鼠中尤為明顯。這說明在單純胰腺物理損傷及適度高糖飲食刺激下，胰島會通過增生、肥大等方式增加胰島素分泌以彌補(bǔ)體內(nèi)胰島素不足從而維持血糖濃度穩(wěn)定。但在兩種因素同時作用時，胰腺的代償已不足以維持血糖濃度穩(wěn)定，機(jī)體長期處于高血糖狀態(tài)，這時殘存胰島超負(fù)荷后即顯示出高血糖狀態(tài)對胰島的毒性作用，因而出現(xiàn)胰島萎縮、beta細(xì)胞減少等改變，出現(xiàn)這一改變后與高血糖狀態(tài)互為因果、相互促進(jìn)啟動糖尿病的進(jìn)程。

4 結(jié)論

單純的胰腺大部分切除或適當(dāng)高糖飲食可刺激胰島細(xì)胞代償性的增生、肥大，而當(dāng)兩者聯(lián)合作用使血糖濃度長期處于較高狀態(tài)時則顯示對胰島細(xì)胞的毒性作用，出現(xiàn)胰島萎縮、beta細(xì)胞減少等改變。

獨(dú)立使用手術(shù)切除大部分胰腺的方法難以制作理想的高血糖大鼠模型，但可制作糖耐量異常的動物模型，聯(lián)合手術(shù)切除及高糖飲食刺激可制成穩(wěn)定的高血糖模型，制作方法可靠，成模率高，但制作糖尿病模型則成模率相對較低。

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